巨噬細胞PPARγ對皮膚傷口愈合的作用研究.pdf

1、皮膚是人體最大的器官，具有抵御冷熱刺激，阻止病原體入侵等重要人體保護功能。由于皮膚常常暴露在外界環(huán)境中，極易損傷。皮膚損傷后，機體啟動修復維持皮膚自身穩(wěn)態(tài)，恢復其完整結(jié)構(gòu)和正常功能。皮膚傷口愈合是一個由免疫細胞，角質(zhì)上皮細胞，成纖維細胞，血管內(nèi)皮細胞，細胞外基質(zhì)，細胞因子以及生長因子等多細胞多介質(zhì)共同參與，多階段有序進行的復雜生理過程?？梢苑譃榻M織炎癥期，組織生成期和組織塑形期。正因為皮膚傷口愈合的復雜性，愈合進程極易受自身條件和外界環(huán)

2、境的干擾而出現(xiàn)障礙，遺留下慢性難愈傷口。了解正常皮膚傷口愈合的調(diào)控機制可以為臨床治療慢性難愈傷口提供理論依據(jù)。
　　巨噬細胞是調(diào)控皮膚傷口愈合的關鍵細胞。巨噬細胞分泌促炎癥因子促進傷口炎癥反應，分泌蛋白酶和活性氧自由基抵抗病原體，分泌抗炎癥因子和吞噬凋亡細胞促進傷口炎癥消退，以及分泌細胞因子，生長因子和趨化因子等作用于角質(zhì)上皮細胞，成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞促進傷口上皮再生，膠原沉積和血管生成[11]。在傷口愈合中，巨噬細胞趨化障礙

3、，吞噬凋亡細胞功能受損，極化異常等都將導致傷口遷延不愈。因此，維持傷口巨噬細胞正常功能對傷口愈合至關重要。目前，對傷口巨噬細胞功能的調(diào)控機制還不清楚。
　　核轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體（Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ）是調(diào)控巨噬細胞功能的重要分子。PPARγ可以促進巨噬細胞吞噬凋亡細胞并使巨噬細胞從促炎癥狀態(tài)轉(zhuǎn)化為抗炎癥狀態(tài)，進而促進炎癥消退。提示PPAR

4、γ在皮膚傷口愈合中對巨噬細胞可能具有一定的調(diào)控作用。我們的研究在于明確巨噬細胞PPARγ在皮膚傷口愈合中的作用及機制。
　　在本研究中，我們首先檢測了野生型（Wild type,WT）小鼠傷口愈合過程中傷口組織以及傷口巨噬細胞PPARγ的表達變化，發(fā)現(xiàn)皮膚損傷后組織和巨噬細胞PPARγ表達上調(diào)，提示組織和巨噬細胞PPARγ對傷口愈合具有調(diào)節(jié)作用。然后我們采用LoxP-Cre系統(tǒng)構(gòu)建了特異敲除巨噬細胞PPARγ（PPARγ-KO）小

5、鼠，同時將基因組含有LoxP位點但不含Cre酶（無巨噬細胞PPARγ敲除，PPARγ-WT）的小鼠作為對照。我們研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ-KO小鼠傷口愈合明顯延遲，傷口肉芽組織生成，膠原沉積和血管生成減少。我們進一步探究 PPARγ-KO小鼠傷口愈合延遲的原因。因為炎癥細胞在傷口的正常浸潤對傷口愈合至關重要，我們在PPARγ-WT和PPARγ-KO小鼠傷口中檢測了中性粒細胞和巨噬細胞的數(shù)目，發(fā)現(xiàn)沒有明顯差異，提示巨噬細胞 PPARγ敲除不影

6、響傷口炎癥細胞浸潤。除炎癥細胞浸潤外，炎癥因子在傷口愈合中也具有重要作用。文獻報道傷口TNF-α過度表達嚴重損害愈合過程。我們研究發(fā)現(xiàn)PPARγ-KO傷口TNF-α表達明顯增多，并且在PPARγ-KO傷口注射抗小鼠TNF-α拮抗劑（Anti-mouse TNF-α,aTNF-α）后傷口愈合明顯加快，肉芽組織生成，膠原沉積和血管生成也明顯增加。由于巨噬細胞是傷口組織細胞因子的主要來源，我們檢測了PPARγ-KO傷口巨噬細胞TNF-α表達后

7、發(fā)現(xiàn)其表達明顯增加。這些結(jié)果說明PPARγ-KO傷口TNF-α過多表達是其愈合障礙的關鍵因素，并且PPARγ-KO巨噬細胞分泌的過多TNF-α促使了傷口TNF-α表達過多。
　　我們進一步研究了PPARγ缺陷引起巨噬細胞分泌過多TNF-α的內(nèi)在機制。在體外實驗中我們發(fā)現(xiàn)，PPARγ-WT和PPARγ-KO在靜息狀態(tài)下都低表達TNF-α。在脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）刺激下，TNF-α表達明顯增多但兩者間沒

8、有差異，說明PPARγ對巨噬細胞分泌TNF-α沒有直接調(diào)控作用。然而，在LPS刺激下加入凋亡胸腺細胞（Apoptotic thymocytes,ATs）后PPARγ-WT巨噬細胞TNF-α表達明顯減少，而PPARγ-KO巨噬細胞TNF-α表達并沒有減少，由于巨噬細胞吞噬凋亡細胞后TNF-α表達會減少，因此提示PPARγ-KO巨噬細胞吞噬凋亡細胞功能障礙。在LPS，ATs和細胞松弛素B（Actin-filament polymerisat

9、ion-blocking agent cytochalasin B）共同孵育下，PPARγ-WT和PPARγ-KO巨噬細胞都持續(xù)高表達TNF-α，說明TNF-α表達減少確由吞噬引起，并且巨噬細胞吞噬二醋酸羧基熒光素（CFSE）標記ATs實驗進一步證明了PPARγ-KO巨噬細胞吞噬率下降。在體內(nèi)實驗中，我們發(fā)現(xiàn)PPARγ-KO傷口凋亡細胞聚集，沒有得到及時有效的吞噬清除。這些結(jié)果證實了PPARγ缺陷導致巨噬細胞吞噬凋亡細胞功能障礙。巨噬細

10、胞吞噬功能與其吞噬相關受體和調(diào)理素（Opsonin）直接相關，我們檢測了PPARγ-WT和PPARγ-KO巨噬細胞吞噬受體CD36，Mertk以及調(diào)理素Mfge8，Gas-6，C1qa，C1qb和C1qc的表達，結(jié)果表明PPARγ-KO巨噬細胞其吞噬相關分子表達下降，提示PPARγ缺陷將下調(diào)巨噬細胞吞噬相關分子的表達。由此證明，PPARγ通過調(diào)控巨噬細胞的吞噬相關分子表達影響其吞噬功能。
　　最后，我們用PPARγ特異激動劑羅格列