組織工程化羊膜促進(jìn)表皮細(xì)胞擴(kuò)增和真皮重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:真皮替代物的研究一直是皮膚組織工程的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是復(fù)合型皮膚替代物發(fā)展的基礎(chǔ)。真皮替代物作為創(chuàng)面修復(fù)過程中的支架結(jié)構(gòu)，不僅能促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，調(diào)節(jié)基底膜的形成，而且能引導(dǎo)成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤增殖，沉積新的膠原和形成新的血管，從而實(shí)現(xiàn)真皮結(jié)構(gòu)重建。迄今為止一系列的真皮替代物已經(jīng)被成功研制出來，包括自然來源的材料，如異體或異種脫細(xì)胞真皮、膠原和透明質(zhì)酸等，以及人工合成材料，包括一些聚合體生物材料和其他納米

2、材料等。另外的一些新型真皮替代物材料也正在被研制之中。在這些真皮替代物中，Integra和Tegaderm等已經(jīng)被商品化并成功運(yùn)用于臨床治療。大部分的真皮替代物都能很好地模擬正常真皮的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但是除了脫細(xì)胞真皮外，普遍都缺乏基底膜結(jié)構(gòu)成分。而且即使是脫細(xì)胞真皮，為了去除表皮細(xì)胞層和真皮中的成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，一般需要很強(qiáng)的細(xì)胞清除劑處理，而后者會(huì)對真皮的基底膜成分產(chǎn)生嚴(yán)重的破壞。
　　 基底膜成分是正常皮膚中重要的成

3、分，位于是表皮和真皮連接處，對于維持皮膚的正常功能起到重要的作用。正常皮膚中的表皮干細(xì)胞主要位于基底層，通過半橋粒結(jié)構(gòu)緊密連接在基底膜表面;后者可以調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞的增殖，遷移和分化。體外分離培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞由于失去了基底膜的支撐和調(diào)節(jié)作用，逐漸喪失了增殖的能力，分化成角質(zhì)形成細(xì)胞。大量的研究表明:在人工合成的真皮支架表面添加自然來源或者人工合成的基底膜成分如Ⅳ型膠原和纖維彈性蛋白等，可以有效地促進(jìn)表皮細(xì)胞的增殖，改善所形成的表皮結(jié)構(gòu)的形

4、態(tài)和功能。
　　 人羊膜基質(zhì)(amniotic membrane，AM)可能是一種良好的真皮替代物材料。它來源于胎盤的最內(nèi)層，可在分娩時(shí)獲得，主要由三部分結(jié)構(gòu)組成:單層立方狀表皮細(xì)胞，富含細(xì)胞生長因子的厚基底膜，以及成纖維細(xì)胞散在其中的疏松網(wǎng)狀纖維基質(zhì)。羊膜基質(zhì)含有Ⅰ型膠原、Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原、彈性蛋白和糖胺聚糖等成分，類似于人體的真皮。羊膜的基底膜主要成分為層粘連蛋白、Ⅳ型和Ⅶ型膠原，與皮膚和角膜的基底膜成分相似，是人體內(nèi)最厚

5、的基底膜。羊膜還具有促進(jìn)上皮化、抑制瘢痕增生、抗炎癥、抗血管生成、抗菌和抗病毒等生物特性，且免疫原性極低，因而被廣泛用作外科手術(shù)材料和創(chuàng)面覆蓋物，尤其是用于眼科角膜重建治療。近年來更有研究者更是將羊膜作為角膜干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、以及其他體細(xì)胞擴(kuò)增和移植的載體，用于修復(fù)各種組織缺損。羊膜使用時(shí)既可以保留失活的表皮細(xì)胞，也可以完全去除表皮細(xì)胞。完整羊膜含有大量的細(xì)胞生長因子，有利于細(xì)胞培育過程中干細(xì)胞特性的維持;而脫細(xì)胞羊膜(accelu

6、llar amniotic membrane，AAM)借助于良好的基質(zhì)和基底膜成分，能促進(jìn)培育細(xì)胞的增殖、遷移和分化;部分體細(xì)胞在脫細(xì)胞羊膜上的擴(kuò)增速度要明顯快于完整羊膜。
　　 在本課題中，我們利用反復(fù)凍融和DNase消化的方法消化處理人新鮮羊膜，獲得保留完整基底膜結(jié)構(gòu)的羊膜基質(zhì);隨后又利用水溶性碳二亞胺對脫細(xì)胞羊膜進(jìn)行適當(dāng)?shù)慕宦?lián)處理，以改善脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度和生物穩(wěn)定性。得到的交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜具有良好的可操作性和抗酶降解能力

7、，作為培養(yǎng)基質(zhì)可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的體外增殖速度，而且保持了良好的生物組織相容性。將表皮細(xì)胞培養(yǎng)在交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜表面形成復(fù)合型表皮-真皮替代物，并將其用于移植修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合皮膚替代物可以明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合速度，改善新生表皮的厚度和功能，促進(jìn)真皮結(jié)構(gòu)重建，減輕創(chuàng)面收縮。
　　 實(shí)驗(yàn)方法:
　　 一、將新鮮羊膜根據(jù)脫細(xì)胞方法的不同分為以下幾組: DispaseⅡ消化+細(xì)胞刷處理組、Freeze-thaw+D

8、Nase消化組和完整羊膜對照組。通過下面的幾種檢測方法觀察不同組的脫細(xì)胞方法效果。
　　 （一）H&E表面和切片染色;
　　 （二）Hoechst細(xì)胞核染色;
　　 （三）免疫組織化學(xué)抗Ⅳ型膠原、Ⅵ型膠原、Ⅶ型膠原、層粘連蛋白(Laminin)、主要組織相容性抗原-Ⅰ(MHC-Ⅰ)、MHC-Ⅱ和波形蛋白(Vimentin)染色;
　　 （四）掃描電鏡和透射電鏡檢查。
　　 二、利用水溶性碳二亞胺（

9、EDC，0.05 mmol/mg AAM）分別交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜5 min，30 min和6h，得到不同交聯(lián)程度的脫細(xì)胞羊膜;然后通過人表皮細(xì)胞經(jīng)浸提液培養(yǎng)和直接接觸培養(yǎng)的方法觀察交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的細(xì)胞毒性效應(yīng);最后將交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜皮下埋置于具有正常免疫功能的大鼠以觀察其體內(nèi)組織相容性。通過以下的方法檢測交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度和生物穩(wěn)定性，以及細(xì)胞毒性效應(yīng)和體內(nèi)外生物組織相容性。
　　 （一）茚三酮法測定脫細(xì)胞羊膜的交聯(lián)程度——交聯(lián)

10、指數(shù);
　　 （二）單軸張力計(jì)測定脫細(xì)胞羊膜交聯(lián)前后的最大張力和最大拉伸長度;
　　 （三）交聯(lián)前后脫細(xì)胞羊膜的體外膠原酶降解速度測定;
　　 （四）CCK-8法和Live/Dead染色觀察表皮細(xì)胞的增殖活性;
　　 （五）H&E染色，Masson三色三膠原染色觀察交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜體內(nèi)埋置后的免疫炎癥反應(yīng)和支架降解情況;
　　 （六）免疫組織化學(xué)抗CD31，CD11b，CD4，CD8，CD68和Vi

11、menin染色觀察支架埋置后浸潤細(xì)胞的類型，評估炎癥反應(yīng)。
　　 三、以交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜為載體體外擴(kuò)增人表皮細(xì)胞，并與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)皿相比較;構(gòu)建表皮細(xì)胞-交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜的復(fù)合型皮膚替代物，并將其用于移植修復(fù)裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，單純表皮膜片移植組和空白組作為對照。通過以下的方法檢測表皮細(xì)胞的體外擴(kuò)增速度和復(fù)合皮膚替代物移植后的創(chuàng)面愈合及真皮重建情況。
　　 （一）CCK-8法和Hoechst細(xì)胞核染色觀察兩組表皮細(xì)胞的擴(kuò)增

12、速度;
　　 （二）免疫組織化學(xué)抗P63染色觀察表皮細(xì)胞的增殖活性;
　　 （三）H&E染色觀察復(fù)合皮膚替代物的形態(tài);
　　 （四）觀察移植創(chuàng)面愈合過程的大體形態(tài);
　　 （五）H&E染色和免疫組織化學(xué)抗laminin染色觀察愈合創(chuàng)面的組織結(jié)構(gòu)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、反復(fù)液氮凍融+DNase消化處理可以完全清除羊膜的上皮細(xì)胞層和間質(zhì)細(xì)胞，而DispaseⅡ消化+細(xì)胞刷法處理后的脫細(xì)

13、胞羊膜仍有少量上皮細(xì)胞殘留，間質(zhì)細(xì)胞則基本不能清除。兩種方法處理后的脫細(xì)胞羊膜DNA總量均顯著降低，組間無明顯差異;但反復(fù)液氮凍融+DNase消化處理的脫細(xì)胞羊膜保留的總蛋白量明顯高于DispaseⅡ消化+細(xì)胞刷處理的脫細(xì)胞羊膜(77.2±4.72％ VS48.5±4.16％，p＜0.05)。反復(fù)液氮凍融+DNase消化處理的脫細(xì)胞羊膜的基底膜成分（層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、Ⅵ型膠原和Ⅶ型膠原）基本保留，且對基質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)無明顯影響;而Dis

14、paseⅡ消化+細(xì)胞刷法處理的脫細(xì)胞羊膜基底膜被嚴(yán)重破壞，蛋白成分丟失明顯，且基質(zhì)膠原纖維變得疏松，排列紊亂。正常羊膜中的表皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)MHC-Ⅰ抗原，不表達(dá)MHC-Ⅱ抗原，其中間質(zhì)細(xì)胞還表達(dá)Vimentin，而在反復(fù)液氮凍融+DNase消化處理的脫細(xì)胞羊膜中幾乎未檢測到MHC-Ⅰ抗原和Vimentin的存在。
　　 二、脫細(xì)胞羊膜的形態(tài)極其柔軟和光滑，經(jīng)過EDC交聯(lián)5 min后依然平整，并具有一定的硬度，而交聯(lián)30m

15、in和6h后逐漸變得卷曲和僵硬。隨交聯(lián)時(shí)間的增加，脫細(xì)胞羊膜的機(jī)械強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，體外膠原酶完全降解時(shí)間也明顯延長，并與交聯(lián)程度存在正相關(guān)關(guān)系。不同交聯(lián)程度的脫細(xì)胞羊膜的浸提液培養(yǎng)7天對人表皮細(xì)胞的增殖活性無不良影響。交聯(lián)5min的脫細(xì)胞羊膜直接負(fù)載人表皮細(xì)胞培養(yǎng)7天后細(xì)胞增殖活性良好，與未交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜組無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05);而交聯(lián)30min和6h的脫細(xì)胞羊膜組的細(xì)胞增殖活性明顯受損，兩組細(xì)胞在培養(yǎng)7天后的凋亡或死亡細(xì)胞比例

16、分別為1.27±0.30％和10.02±1.43％，明顯高于未交聯(lián)和交聯(lián)5 min脫細(xì)胞羊膜組的0.42±0.14％和0.44±0.18％(p均＜0.05)。皮下埋置后的組織相容性檢測結(jié)果顯示交聯(lián)5 min的脫細(xì)胞羊膜在體內(nèi)的完全降解時(shí)間約為4個(gè)月，降解后形成一層厚的皮下組織，膠原沉積和血管化良好，并無明顯的急慢性炎癥反應(yīng)發(fā)生。
　　 三、表皮細(xì)胞在交聯(lián)5 min的脫細(xì)胞羊膜表面種植培養(yǎng)7和14天后的細(xì)胞相對增殖率分別為367±

17、33％和631±43％，顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的常規(guī)培養(yǎng)皿組(294±30％和503±41％，p均＜0.05)。培養(yǎng)14天后表皮細(xì)胞在交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜表面形成一個(gè)2-3層的復(fù)層表皮結(jié)構(gòu)。免疫組化染色結(jié)果顯示交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜上P63陽性表皮細(xì)胞的比例明顯高于對照的常規(guī)培養(yǎng)皿組(54.32±4.27％ VS33.32±3.18％，p＜0.05)。將培養(yǎng)形成的表皮細(xì)胞-交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜復(fù)合皮膚替代物移植于裸鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面后，表皮細(xì)胞成活良好并完全封

18、閉創(chuàng)面，形成類似正常皮膚的表皮。復(fù)合皮膚替代物移植組的創(chuàng)面修復(fù)效果要明顯優(yōu)于單純表皮膜片組和空白對照組，創(chuàng)面收縮明顯改善。創(chuàng)面組織學(xué)觀察結(jié)果提示復(fù)合皮膚替代物移植后創(chuàng)面的真皮結(jié)構(gòu)重建良好，新生基底膜厚而完整。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
　　 一、反復(fù)液氮凍融+DNase消化的脫細(xì)胞方法能有效去除羊膜的上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，優(yōu)于傳統(tǒng)的DispaseⅡ消化+細(xì)胞刷處理方法;更重要的是該方法能有效保留羊膜的基質(zhì)成分，尤其是基底膜結(jié)構(gòu)，且

19、脫細(xì)胞后羊膜的免疫原性極低。
　　 二、EDC(0.05 mmol/mg AAM)交聯(lián)5min的脫細(xì)胞羊膜，不僅具備改善了的機(jī)械強(qiáng)度和抗酶降解能力，而且無明顯細(xì)胞毒性效應(yīng)，能有效負(fù)載表皮細(xì)胞的粘附和增殖。皮下埋置實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜具有良好的體內(nèi)生物組織相容性和降解特性。
　　 三、交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜作為真皮替代物在體外可以負(fù)載并促進(jìn)表皮細(xì)胞的快速擴(kuò)增，有利于維持細(xì)胞的增殖能力。用交聯(lián)脫細(xì)胞羊膜構(gòu)建復(fù)合型皮膚替代物并