組織工程化髓核種子細胞優(yōu)化獲取的實驗研究.pdf

1、目的：
　　椎間盤退變?yōu)檠惩粗饕蛑?，其退變主要是由于椎間盤細胞減少和細胞外基質成份的改變，盡管并沒明確椎間盤內細膽的性質，但是研究表明：髓核細胞與軟骨細胞在某些方面有很多共性.近年來研究表明：細胞移植可以達到組織功能上的修復，所以此方法最有希望成為治療椎間盤退變的最佳辦法.因為干細胞可以向軟骨樣細胞方面分化，所以大部分學者主要通過改變細胞外環(huán)境等來研究骨髓間充質干細胞向軟骨樣細胞分化.最近研究表明：人體脂肪組織中的脂肪干細

2、胞含量較豐富，而脂肪干細胞在不同的獲取技術下可分化為軟骨樣細胞，如轉基因和不同生長因子聯合誘導脂肪干細胞向軟骨樣細胞分化技術.所以我們設計這個試驗就是為了探索比較體外培養(yǎng)的骨髓間充質干細胞(Bone、Marrow Msenchymal Stem Cells，BMSCs)和脂肪干細胞(Adipose Stem Cells，ASCs)變化，以及堿性成纖維細胞生長因子(Basic Fibroblast Growth Factor，BFGF)對

3、其代謝的影響.
　　方法：
　　1．抽取日本大耳白兔骨髓，用全骨髓培養(yǎng)法進行BMACs的體外培養(yǎng)、擴增.取日本大耳白兔肩胛間的脂肪組織，在0．075％Ⅱ型膠原酶溶液中下剪碎并消化1小時(37℃)，所得的消化液過濾離心獲取脂肪干細胞，進行體外單層培養(yǎng)擴增，所收集的骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞分別用DMEM、DME/F12(2：1)、α-MEM培養(yǎng).倒置顯微鏡觀察骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞的形態(tài)改變，分別比較兔骨髓間充質干細胞

4、和脂肪干細胞的數量.
　　2．當細胞傳三代后，胰蛋白酶消化收集的脂肪干細胞和骨髓間充質干細胞沉淀以2×105/ml接種到24cm2的培養(yǎng)瓶里，用軟骨誘導培養(yǎng)基(Chondrogenic、Medium，CM)進行誘導，CM的組成：1．25mg/ml牛血清白蛋白、10ng／mlTGF-β1、100nmol／L地塞米松、50μg／mL維生素C、100μg／mL丙酮酸鈉、40μg／mL脯氨酸、1％ITS-plus(10mg/ml胰島素，6

5、．7mg/ml亞硒酸鈉，5．5mg/ml轉鐵蛋白，2ng／ml乙醇胺)的DMEX/F12(2：1)培養(yǎng)液
　　3．免骨髓間充質干細胞和脂肪干細胞分為4組后分別進行誘導培養(yǎng)三周，即A組，BMSs+CM;B組，BMSC+CM+5ng／mlBFGF；C組，ASCs+CM；D組，ASCs+CM+5ng／mlBFGF，測定培養(yǎng)液上清羥脯氨酸含量和譬35SO42-基摻入量.
　　結果：
　　1.α-MEM培養(yǎng)基比DME、DMEM、

6、/F12(2：1)制備的BMSCs和ASCs所需時間大大縮短.
　　2．單層培養(yǎng)：單層培養(yǎng)的BMSCs和ASCs增殖較快貼壁較牢且生成細胞集落，然而在CM誘導后，細胞增殖較慢，貼壁不牢，且細胞沒有集落生成.
　　3．誘導后的BMSCs和ASCs的形狀趨向于類圓形，B組的細胞數量比A組的細胞多，D的細胞數量比C組的細胞多.B組比A組表達的羥脯氨酸增加,35SO42-攝入量增加，D組分別比C組表達羥脯氨酸增加、35SO42-攝入