骨髓間質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:理想的人造心臟瓣膜應(yīng)當(dāng)具有天然瓣膜的生物學(xué)結(jié)構(gòu),無(wú)免疫源性,具有自我更新和生長(zhǎng)能力,耐久性好能終生使用.組織工程心臟瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)具有自體活細(xì)胞,能夠自我更新和改建,生物力學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)性能優(yōu)良,耐久性好,無(wú)需抗凝,符合理想人造心臟瓣膜的條件.幾年來(lái)經(jīng)過(guò)眾多研究者的努力,TEHV研制取得了令人矚目的進(jìn)展,但過(guò)度到臨床應(yīng)用尚需在種子細(xì)胞、支架材料、構(gòu)建方式及相關(guān)設(shè)備等方

2、面進(jìn)一步完善.目前構(gòu)建TEHV的種子細(xì)胞主要是來(lái)源于自體血管壁的成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞,但從自體血管壁獲取種子細(xì)胞不但技術(shù)復(fù)雜,培養(yǎng)周期較長(zhǎng),而且會(huì)給機(jī)體造成一定創(chuàng)傷,常規(guī)臨床應(yīng)用并不現(xiàn)實(shí);支架材料主要有生物可降解合成聚合物支架和天然瓣膜支架.鑒于現(xiàn)有合成支架材料的性能還達(dá)不到構(gòu)建瓣膜組織的要求,而同種心臟瓣膜的來(lái)源缺乏,TEHV支架材料的研究仍以去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣為主.雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)去細(xì)胞異種瓣膜支架的免疫反應(yīng)及炎性反應(yīng)微弱,但臨床試驗(yàn)

3、已有去細(xì)胞豬瓣(SynerGraft瓣)發(fā)生早期衰壞及功能障礙的報(bào)道,表明現(xiàn)有的去細(xì)胞方法并不理想,必須改進(jìn).本研究嘗試采用血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的可行性,以尋找更為便捷可行的種子細(xì)胞來(lái)源.應(yīng)用低濃度胰酶+表面活性劑脫氧膽酸(de

4、oxycholic acid,DCA)+核酸酶的方法制作去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架,以探索去細(xì)胞效果確切而又能有效保留天然瓣膜生物力學(xué)性能的去細(xì)胞方法.通過(guò)BMSCs分化細(xì)胞的種植實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步考察BMSCs在去細(xì)胞支架上生長(zhǎng)的生物學(xué)行為,評(píng)價(jià)用BMSCs構(gòu)建TEHV的可行性.方法:1.綿羊BMSCs的體外培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化研究髂嵴穿刺抽取綿羊骨髓液,Percoll密度梯度離心法獲取BMSCs,DMEM培養(yǎng)液體外培養(yǎng)擴(kuò)增,采用α-SMA、vimen

5、tin免疫組化染色及α-SMA表達(dá)的流式細(xì)胞儀(FCM)分析鑒定細(xì)胞表型.免疫組化Ⅰ、Ⅲ型膠原染色評(píng)價(jià)BMSCs分泌膠原的功能.以含表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF),堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulinlike growthfactor,IGF)和肝素的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)原代細(xì)胞,并以VEGF誘導(dǎo)BMSCs

6、向內(nèi)皮細(xì)胞分化.通過(guò)CD34、CD31流式細(xì)胞儀分析,免疫組化CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定內(nèi)皮細(xì)胞,荊豆凝集素(ulex europaeus agglutinin,UEA)結(jié)合實(shí)驗(yàn)及一氧化氮(NO)含量測(cè)定評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞功能.2.去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架的制備在豬宰殺后20分鐘內(nèi)清潔條件下取出心臟,4℃冰鹽水沖洗.切取主動(dòng)脈瓣葉或帶瓣主動(dòng)脈管道.瓣葉采用75﹪酒精消毒2分鐘,主動(dòng)脈帶瓣管道修剪后30KGray γ射線照射消毒.分別采用0

7、.01﹪胰蛋白酶+核酸酶+1﹪Triton持續(xù)震蕩24小時(shí)(組1),0.01﹪胰酶8小時(shí)+核酸酶+1﹪DCA持續(xù)震蕩24小時(shí)(組2)及1﹪DCA+核酸酶持續(xù)震蕩32小時(shí)(組3)三種方法對(duì)新鮮豬主動(dòng)脈瓣葉及帶瓣主動(dòng)脈管道進(jìn)行去細(xì)胞處理.新鮮瓣葉作為對(duì)照(組4).去細(xì)胞效果的評(píng)價(jià):通過(guò)常規(guī)石臘包埋切片HE染色,掃描電鏡及透射電鏡觀察評(píng)價(jià)去細(xì)胞瓣葉的組織學(xué)結(jié)構(gòu)和去細(xì)胞效果.去細(xì)胞瓣葉的生物力學(xué)性能評(píng)價(jià):應(yīng)用單軸拉伸實(shí)驗(yàn)繪制應(yīng)力-應(yīng)變曲線、應(yīng)力

8、松馳曲線,測(cè)定各組瓣葉在應(yīng)力為0.3MPa時(shí)的彈性模量,加載-卸載曲線下的面積比,同一應(yīng)力下的伸長(zhǎng)比及松馳率.通過(guò)拉斷實(shí)驗(yàn)測(cè)量各組瓣葉的最大抗張強(qiáng)度及斷裂伸長(zhǎng)比.運(yùn)用Student-t檢驗(yàn)比較各組去細(xì)胞瓣葉的生物力學(xué)指標(biāo).去細(xì)胞支架的免疫源性及炎性反應(yīng)評(píng)價(jià):將去細(xì)胞瓣葉及主動(dòng)脈管道裁剪后植入SD大鼠背部皮下,并分別于包埋2周和4周后取出瓣葉,4周和8周后取出主動(dòng)脈壁及瓣下肌肉組織,切片HE染色及免疫組化vimentin、α-SMA染色評(píng)

9、價(jià)去細(xì)胞支架的免疫源性、體內(nèi)炎性反應(yīng)及改建情況.3.組織工程心臟瓣膜的體外構(gòu)建采用靜態(tài)、立體及分次種植的方法將BMSCs分化的肌成纖維樣細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞分別種植于去細(xì)胞瓣葉及整體主動(dòng)脈瓣支架上構(gòu)建TEHVs.分別于DMEM和M199全培養(yǎng)液中培養(yǎng)7~8天后取出,通過(guò)石臘包埋切片HE染色,掃描及透射電鏡觀察評(píng)價(jià)TEHVs的組織學(xué)結(jié)構(gòu),考察BMSCs及其分化細(xì)胞在去細(xì)胞天然瓣膜支架上生長(zhǎng)的生物學(xué)行為.免疫組化α-SMA、CD34及Ⅷ因子相關(guān)抗

10、原染色鑒定種植細(xì)胞的表型.結(jié)果:1.原代培養(yǎng)的BMSCs貼壁后呈三角形、多角形和梭形,3~5天后呈集落樣生長(zhǎng).傳代細(xì)胞為均一梭形,呈指數(shù)增殖,5ml骨髓液分離得到的BMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增2周即可獲取10<'7>~10<'8>個(gè)細(xì)胞.其自然分化細(xì)胞α-SMA、vimentin及Ⅰ、Ⅲ型膠原染色陽(yáng)性,α-SMA表達(dá)水平(平均熒光強(qiáng)度)與血管壁肌成纖維細(xì)胞無(wú)明顯差異,超微結(jié)構(gòu)示胞漿內(nèi)含有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌小泡,提示具有旺盛的分泌功能;B

11、MSCs經(jīng)內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)及VEGF體外誘導(dǎo)2周后分化為內(nèi)皮細(xì)胞,呈三角形及多角形,表達(dá)CD34和CD31及Ⅷ因子相關(guān)抗原,UEA結(jié)合試驗(yàn)陽(yáng)性,培養(yǎng)液中NO含量明顯高于單純擴(kuò)增培養(yǎng)的BMSCs(29.7±2.78 μ mol vs 15.12±1.34 μ mol P<0.05),與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相比則無(wú)明顯差異(29.7±2.78 μ mol vs 32.21±2.61 μ mol P>0.05).超微結(jié)構(gòu)示細(xì)胞內(nèi)可見Weibel-Pa

12、lade小體.2.采用0.01﹪胰蛋白酶+核酸酶+1﹪DCA相結(jié)合的方法(組2)能夠完全去除豬主動(dòng)脈瓣葉及主動(dòng)脈壁上的細(xì)胞成份,而波浪狀纖維支架結(jié)構(gòu)保存完好.組1和組3未能去除主動(dòng)脈壁深層的細(xì)胞及瓣下肌肉的細(xì)胞核成份.各組去細(xì)胞瓣葉的最大抗張強(qiáng)度均低于新鮮瓣葉,組2去細(xì)胞瓣葉的彈性模量及最大抗張強(qiáng)度大于組1(分別為5.77±0.95 MPa vs 4.15±1.13MPa和7.82±1.51MPa vs 4.65±0.85MPa P<0

13、.05).該組瓣葉應(yīng)力伸長(zhǎng)比及斷裂伸長(zhǎng)比則小于組1(0.45±0.02 vs 0.60±0.06 P<0.05),與新鮮瓣葉無(wú)明顯差異(0.45±0.02 vs 0.46±0.03 P>0.05).提示組2去細(xì)胞瓣葉的生物力學(xué)性能優(yōu)于組1.大鼠皮下包埋瓣葉及管道組織切片HE染色示組2去細(xì)胞支架的炎癥反應(yīng)輕微,宿主成纖維細(xì)胞能夠長(zhǎng)入去細(xì)胞主動(dòng)脈瓣葉及管道,并對(duì)其進(jìn)行改建.新鮮瓣葉及組1、組3去細(xì)胞支架的免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)明顯,支架結(jié)構(gòu)破壞

14、.3.由BMSCs自然分化細(xì)胞構(gòu)建的TEHV HE染色示BMSCs分化的肌成纖維樣細(xì)胞在去細(xì)胞支架上呈復(fù)層生長(zhǎng),細(xì)胞間有基質(zhì)形成,免疫組化染色示α-SMA陽(yáng)性,掃描電鏡檢查示去細(xì)胞支架表面為致密細(xì)胞層覆蓋,細(xì)胞呈梭形,排列有序,細(xì)胞間有絲狀纖維相連.透射電鏡示瓣葉表面為長(zhǎng)梭形復(fù)層細(xì)胞覆蓋,細(xì)胞胞漿內(nèi)有大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及粗大分泌顆粒,表明細(xì)胞合成及分泌功能旺盛.細(xì)胞間有基質(zhì)形成.4.誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出與成熟內(nèi)皮細(xì)胞相同的生物學(xué)行為,由分

15、化內(nèi)皮細(xì)胞所構(gòu)建的TEHV組織學(xué)切片HE染色示內(nèi)皮細(xì)胞在支架上形成了完整的單細(xì)胞層,免疫組化染色示CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原陽(yáng)性,掃描電鏡檢查示去細(xì)胞支架表面為單層細(xì)胞覆蓋,細(xì)胞呈梭形,表面光滑,排列有序,細(xì)胞間纖維連接較少.透射電鏡示支架表面為單細(xì)胞層,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及分泌顆料較少.5.整體瓣膜支架細(xì)胞種植實(shí)驗(yàn)表明BMSCs及誘導(dǎo)分化內(nèi)皮細(xì)胞能夠在管道內(nèi)表面及瓣葉主動(dòng)脈面生長(zhǎng).BMSCs自然分化細(xì)胞在管道內(nèi)表面呈復(fù)層均勻生長(zhǎng),而誘導(dǎo)分

16、化內(nèi)皮細(xì)胞則在管道內(nèi)表面形成了完整的單細(xì)胞層.結(jié)論:1.采用0.01﹪胰酶(8小時(shí))+核酸酶+1﹪DCA相結(jié)合的方法能夠完全去除豬主動(dòng)脈瓣葉及主動(dòng)脈壁上的細(xì)胞成份,去細(xì)胞瓣膜支架的免疫源性大大降低,且纖維支架結(jié)構(gòu)保留完好,生物力學(xué)性能無(wú)明顯影響.其去細(xì)胞效果優(yōu)于0.01﹪胰酶+1﹪Triton+核酸酶及1﹪DCA+核酸酶的方法.2.BMSCs獲取方便,對(duì)機(jī)體創(chuàng)傷微小,體外擴(kuò)增能力強(qiáng)大,5ml骨髓液分離得到的BMSCs在體外培養(yǎng)擴(kuò)增2周即

17、可獲取10<'7>~10<'8>個(gè)細(xì)胞,能夠達(dá)到構(gòu)建TEHV所需的細(xì)胞數(shù)量.BMSCs的自然分化細(xì)胞為肌成纖維樣細(xì)胞,在去細(xì)胞天然瓣膜支架上呈復(fù)層生長(zhǎng),并能夠合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì).3.在內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)及VEGF的誘導(dǎo)下BMSCs可分化為內(nèi)皮細(xì)胞,表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞表型,并具有內(nèi)皮細(xì)胞功能,在去細(xì)胞天然瓣膜支架上形成完整的單細(xì)胞層.為TEHV提供完整光滑的表面.4.BMSCs分化細(xì)胞的生物學(xué)特性與血管壁細(xì)胞相似,應(yīng)用BMSCs作為種子細(xì)胞去細(xì)