RGD交聯(lián)去細(xì)胞牛心包構(gòu)建組織工程心臟瓣膜支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我國(guó)是風(fēng)濕性心臟病的高發(fā)國(guó)家，每年至少有10萬(wàn)例患者需要瓣膜置換?，F(xiàn)有的人造心臟瓣膜存在著缺陷：機(jī)械瓣需終生抗凝，容易發(fā)生出血及血栓栓塞并發(fā)癥；生物瓣由于組織退行性變、鈣化而導(dǎo)致瓣膜衰壞和功能障礙。因此，具有生長(zhǎng)能力和修復(fù)功能的組織工程心臟瓣膜（tissueengineeredheartvalves,TEHV）成為研究的方向和熱點(diǎn)。
　　理想的支架材料是構(gòu)建具有生物活性功能TEHV至關(guān)重要的問(wèn)題，其應(yīng)當(dāng)具有良好的生物力學(xué)性能和組織

2、相容性。目前國(guó)內(nèi)外還未有理想的TEHV，主要的一個(gè)問(wèn)題就在于尚沒(méi)有理想的TEHV支架材料。已有的支架材料存在各自缺陷：合成材料由于機(jī)械強(qiáng)度不足，缺乏ECM成份及適合的可降解性等問(wèn)題，未有成功應(yīng)用的報(bào)道；生物支架保存了較完整的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）成份，同時(shí)有良好的機(jī)械性能而具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但也存在細(xì)胞黏附及在支架內(nèi)部生長(zhǎng)困難等問(wèn)題。如何克服材料固有缺陷，改良出符合TEHV要求的支架，是目前國(guó)內(nèi)外研究的

3、重點(diǎn)。
　　牛心包(bovinepericardium，BP)是一種取材方便，臨床應(yīng)用廣泛的生物材料，本課題針對(duì)牛心包生物材料，改進(jìn)處理方法，采用胰酶+TritonX-100法去除牛心包細(xì)胞成份，觀察了不同去細(xì)胞時(shí)間對(duì)材料組織學(xué)、生物力學(xué)性能的影響；并采用乙酸（aceticacid，AA）對(duì)去細(xì)胞牛心包（acellularbovinepericardium，ABP）進(jìn)一步改良，提高材料孔徑及孔隙率，同時(shí)首先在生物材料表面共價(jià)交聯(lián)R

4、GD多肽，進(jìn)一步增加對(duì)種子細(xì)胞黏附、遷移及增殖的影響；同時(shí)體外培養(yǎng)、鑒定人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（humanmesenchymalstemcells，hMSCs），并進(jìn)行RGD多肽對(duì)hMSCs生物學(xué)功能影響實(shí)驗(yàn)；將改良后的ABP支架材料進(jìn)行體外hMSCs種植實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步對(duì)乙酸處理、RGD多肽交聯(lián)的改良ABP作為TEHV支架材料的可行性進(jìn)行探討與研究。
　　第一部分：采用我們研究組過(guò)去首先應(yīng)用的胰酶+TritonX-100，結(jié)合DNA酶與

5、RNA酶去細(xì)胞方法進(jìn)行BP去細(xì)胞處理，對(duì)不同TritonX-100處理時(shí)間的去細(xì)胞效果，ABP的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、力學(xué)性能進(jìn)行對(duì)照研究。結(jié)果提示采用胰酶+TritonX-100方法，可以完全脫除牛心包內(nèi)細(xì)胞成份。TritonX-100高、低滲溶液去細(xì)胞處理8h組在完全去除細(xì)胞成份的基礎(chǔ)上，能保持膠原纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)和排列，其力學(xué)性能較BP有明顯下降，但最大拉伸強(qiáng)度（Maximumtensilestrength，Tmax）仍保持在12.61±0.64

6、MPa的較高水平。說(shuō)明經(jīng)過(guò)適合時(shí)間胰酶+TritonX-100去細(xì)胞處理得到的ABP支架具有較好的生物相容性及力學(xué)強(qiáng)度，符合組織工程瓣支架材料的基本要求。
　　第二部分：采用AA對(duì)ABP進(jìn)一步改良，提高材料孔徑及孔隙率，同時(shí)我們首先在材料表面共價(jià)交聯(lián)RGD多肽，以期進(jìn)一步增加對(duì)種子細(xì)胞黏附、遷移及增殖的影響。結(jié)果顯示：AA處理ABP材料，使材料的孔陘及孔隙率明顯提高（162.2±24.3um，94.7±1.8％，p＜0.01），相

7、比膠原酶處理，AA處理能在提高材料孔徑及孔隙率的基礎(chǔ)上保持較好的膠原纖維排列和力學(xué)強(qiáng)度（Tmax=9.93±0.82MPa）；通過(guò)EDC/NHS共價(jià)交聯(lián)RGD多肽，可以在ABP材料表面大量牢固結(jié)合RGD多肽。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果將為種子細(xì)胞在支架材料上的黏附、遷移和增殖創(chuàng)造良好的條件。
　　第三部分：分離培養(yǎng)、鑒定hMSCs，并通過(guò)膠原膜黏附實(shí)驗(yàn)初步觀察RGD多肽對(duì)hMSCs生物學(xué)性能的影響。結(jié)果表明：通過(guò)通過(guò)密度梯度離心法、貼壁篩選法可

8、成功分離出hMSCs；采用10％胎牛血清（fetalcalfserum，F(xiàn)CS）/DMEM培養(yǎng)體系對(duì)hMSCs體外培養(yǎng)、擴(kuò)增順利；流式細(xì)胞儀檢測(cè)3-7代（P3-7）hMSCs表面標(biāo)志：CD73、CD105、CD166、CD90及CD44(粘附分子，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))為陽(yáng)性；CD34、CD31及CD45持續(xù)陰性，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞具備MSC的表面標(biāo)記特點(diǎn)，細(xì)胞成分均一，純度在98％以上，具有高度的同源性；體外RGD交聯(lián)膠原膜，明顯增加hMS

9、Cs的黏附，加快細(xì)胞骨架合成，說(shuō)明以RGD多肽交聯(lián)ABP為支架可能大大增強(qiáng)hMSCs的黏附、遷移及增殖。
　　第四部分：將改良后的ABP支架材料進(jìn)行體外hMSCs種植實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與單純?nèi)ゼ?xì)胞處理（ABP）、AA處理（AA）及RGD多肽交聯(lián)（RGD）的ABP相比，hMSCs黏附數(shù)量明顯增多，種植10天后在AA處理同時(shí)有RGD多肽交聯(lián)的ABP（RGD-AA）材料孔隙內(nèi)hMSCs生長(zhǎng)和增殖良好，并分泌ECM成份。表明AA處理聯(lián)合RG

10、D交聯(lián)可以大大增強(qiáng)hMSCs黏附，提高細(xì)胞生長(zhǎng)活性，同時(shí)hMSCs可以在材料內(nèi)部順利生長(zhǎng)。說(shuō)明AA處理聯(lián)合RGD交聯(lián)的ABP材料具有作為TEHV支架材料具有良好應(yīng)用前景。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)我們研究組過(guò)去應(yīng)用的通過(guò)胰酶（2h）+TritonX-100（高、低滲溶液各8h）方法去細(xì)胞處理，可以完全去除新鮮牛心包內(nèi)的細(xì)胞成份，并顯著降低材料內(nèi)可溶性蛋白，大大降低了材料的免疫原性；同時(shí)材料保持了良好的力學(xué)性能；牛心包材料具有力學(xué)

11、的各向異性，其纖維走向?qū)αW(xué)性能有明顯影響，沿平行纖維走向的力學(xué)性能最強(qiáng)。乙酸處理可以明顯提高去細(xì)胞牛心包材料的孔徑及孔隙率，克服了以往生物材料低孔徑、孔隙率的缺點(diǎn)，同時(shí)還保留了材料較好的機(jī)械性能。采用的密度梯度離心和貼壁分離法分離hMSCs，以10％FCS/DMEM培養(yǎng)體系培養(yǎng)，在多次傳代后hMSCs增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)趨于一致，表型穩(wěn)定。我們首先應(yīng)用RGD多肽通過(guò)EDC/NHS法大量牢固結(jié)合于去細(xì)胞牛心包表面，實(shí)驗(yàn)表明，RGD可以明