異位再生組織中牙源性干細(xì)胞的生物學(xué)性能研究.pdf

1、干細(xì)胞是一類可以自我更新、可以分化成特定類型的功能細(xì)胞。根據(jù)來(lái)源的不同,干細(xì)胞一般分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells)和成體干細(xì)胞(adult stem cells)。胚胎干細(xì)胞可以分化為體內(nèi)所有類型的細(xì)胞,而成體干細(xì)胞可以分化為相應(yīng)器官的所有類型的細(xì)胞(如造血干細(xì)胞可以分化為造血系統(tǒng)所有類型的細(xì)胞)。再生醫(yī)學(xué)就是將干細(xì)胞先分化為特定類型的功能細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等),再將這些細(xì)胞移植到病人體內(nèi),替

2、代損傷的組織,這種細(xì)胞治療不是簡(jiǎn)單的用健康的細(xì)胞替代損傷的組織,而是使細(xì)胞移植后繼續(xù)增殖分化行使功能從根本上治愈疾病。干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)給治療退行性疾病、不可逆性疾病帶來(lái)全新的手段和希望,引起各國(guó)政府的重視和大眾的關(guān)注,在全球掀起干細(xì)胞研究及應(yīng)用的熱潮,干細(xì)胞治療必將成為未來(lái)醫(yī)學(xué)的主流。
　　近年來(lái),從兒童和成人的牙齒相關(guān)組織如牙齦、牙周膜、齦乳頭、濾泡和牙髓中均發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞[1-6]。這些干細(xì)胞來(lái)源于外胚間充質(zhì),與骨髓間充質(zhì)來(lái)

3、源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)具有類似的生物學(xué)特性如表達(dá)Stro-1、CD146、CD105等表面標(biāo)記,能夠分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等特性。不僅如此,牙源性干細(xì)胞來(lái)源廣泛,可以從醫(yī)療廢棄物中獲得,如阻生牙、正畸需要拔除的牙等,因此它們具有更為廣闊的應(yīng)用前景[7]。
　　牙髓干細(xì)胞(Dental pulp stem cells,DPSCs)和牙周膜干

4、細(xì)胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)均源于外胚間充質(zhì),由神經(jīng)脊細(xì)胞發(fā)育而來(lái)[8]。是研究較早、研究較多的兩種牙源性干細(xì)胞,不僅體外可以被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)源性細(xì)胞等[9],在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,這些分化潛能也可以得到不同程度的表達(dá)[10,11]。值得注意的是將DPSCs和PDLSCs分別與羥磷灰石-磷酸三鈣復(fù)合植入裸鼠體內(nèi)后,分別形成了牙髓-牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)[3]和類牙周膜樣組

5、織[4]。許多大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明 DPSCs和PDLSCs是再生牙髓組織和牙周組織最有前景的細(xì)胞,并且已有將牙髓干細(xì)胞[12]和牙周膜干細(xì)胞[13]運(yùn)用于臨床治療的報(bào)道,但其長(zhǎng)期療效還有待進(jìn)一步研究。
　　值得思考的是,實(shí)驗(yàn)證明將牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞移植入體內(nèi)后細(xì)胞依然長(zhǎng)期存在自我更新和多向分化的潛能[14,15]。例如,牙髓干細(xì)胞在一定條件下可被誘導(dǎo)生成類間充質(zhì)樣細(xì)胞[16],將誘導(dǎo)后的細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)可以分化生成

6、類牙髓樣組織結(jié)構(gòu),證實(shí)誘導(dǎo)后細(xì)胞依然具有分化再生潛能。還有學(xué)者將羊的牙周膜干細(xì)胞在移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi),8周后,移植細(xì)胞依然存在活性;雖然與原牙周膜干細(xì)胞相比移植后的細(xì)胞的自我增殖和多向分化能力有所降低,但其依然可以在體內(nèi)誘導(dǎo)分化形成纖維樣結(jié)構(gòu)和血管樣結(jié)構(gòu)[14]。盡管已有實(shí)驗(yàn)在一定程度上表明牙源性干細(xì)胞在體內(nèi)再生時(shí)可以保持一定的的穩(wěn)定性,但是目前沒(méi)有明確的實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞體內(nèi)再生時(shí)干性的保持能力,也沒(méi)有研究評(píng)價(jià)過(guò)

7、兩種干細(xì)胞再生前后所具有的生物學(xué)特性發(fā)生的變化。本研究中,我們通過(guò)牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的異位再生實(shí)驗(yàn),成功獲取了具有代表性的再生后牙髓樣細(xì)胞(Re-isolated cells from regenerated dental pulp-like tissues,re-DPCs)和再生后牙周膜樣細(xì)胞（Re-isolated cells from regenerated periodontal ligament-like tissues

8、,re-PDLCs),從細(xì)胞水平和分子水平評(píng)價(jià)DPSCs與re-DPCs,PDLSCs與re-PDLCs的細(xì)胞生物學(xué)特性的差異以及干性保持的穩(wěn)定性,結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)研究,進(jìn)一步探索干細(xì)胞應(yīng)用于臨床再生治療的可行性。
　　目的:
　　利用 DPSCs和PDLSCs進(jìn)行異位牙髓牙周組織再生,鑒定再分離的細(xì)胞是否仍然具有自我更新及多向分化潛能等干細(xì)胞的特性,并比較再生后組織中細(xì)胞與DPSCs、PDLSCs生物學(xué)特性的差異,從而判

9、定DPSCs和PDLSCs在再生過(guò)程中能否保持干細(xì)胞穩(wěn)定性,為干細(xì)胞的的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.DPSCs和PDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用組織塊培養(yǎng)法分別培養(yǎng)牙髓細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞;通過(guò)有限稀釋法分離、純化得到牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后兩種細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　2.DPSCs和PDLSCs牙本質(zhì)復(fù)合物的制備、異位移植及再生后組織免疫原性鑒定:誘導(dǎo)DPSCs和PDL

10、SCs形成細(xì)胞膜片,分別與預(yù)處理過(guò)的牙本質(zhì)管/牙本質(zhì)柱復(fù)合成 DPSCs牙本質(zhì)管復(fù)合體/PDLSCs牙本質(zhì)柱復(fù)合體,植入免疫缺陷小鼠背部皮下,60天后取材,從再生組織中分離培養(yǎng)細(xì)胞,分離培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),鑒定其來(lái)源;流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后兩種細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記物。
　　3.DPSCs和PDLSCs再生前后生物學(xué)性能比較:通過(guò)噻唑藍(lán)比色法、成纖維細(xì)胞集落形成單位檢測(cè)DPSCs和re-DPCs以及PDLSCs和re-P

11、DLCs的自我更新能力;成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、對(duì)比分析牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞的多向分化潛能。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本實(shí)驗(yàn)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式統(tǒng)計(jì)結(jié)果。使用 t檢驗(yàn)對(duì)兩組間的差異進(jìn)行比較,使用單因素方差分析分析多組之間的差異,取α=0.05。所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1.成功分離培養(yǎng) DPSCs和PDLSCs,顯微鏡下觀察

12、兩種細(xì)胞均呈梭形,集落樣生長(zhǎng);流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物STRO-1、CD146、CD29、CD90和CD105,陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34和CD45。
　　2.分離、培養(yǎng)所得再生組織細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)人細(xì)胞膜表面線粒體抗體,證明實(shí)驗(yàn)所得再生組織細(xì)胞為植入的人來(lái)源的細(xì)胞;波形蛋白抗體染色,證明所得細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)。
　　純化所得再生組織細(xì)胞,命名為:再生后牙髓樣細(xì)胞(re-D

13、PCs)和再生后牙周膜樣細(xì)胞(re-PDLCs);流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后的re-DPCs陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記: STRO-1(4.0％)、CD146(19.7%)、CD105(78.5%)、CD29(85.3%)、CD90(99.7%);陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34(2.0%)和CD45(1.6%);以上結(jié)果與間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞所具有的特征相一致;re-PDLCs中只有CD90(52.3%)呈陽(yáng)性表達(dá),而陰性表達(dá)STRO-1(2.7%

14、)、CD146(4.6%)、CD105(11.8%)、CD29(17.4%);陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34(1.9%)和CD45(0.8%)。再生后牙髓樣細(xì)胞和再生后牙周膜樣細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)均低于原牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞,且re-PDLCs表達(dá)更低。
　　3.牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和克隆形成率比較:DPSCs的增殖能力強(qiáng)于 re-DPCs,其中 DPSCs克隆形成率為2

15、4.3±1.2%,re-DPCs克隆形成率為23.8±1.3%,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。PDLSCs再生前后的生長(zhǎng)曲線和克隆形成率進(jìn)行比較,PDLSCs的增殖能力明顯強(qiáng)于re-PDLCs,其中PDLSCs克隆形成率為20.6±1.4%,re-DPCs克隆形成率為0%(P<0.05)。
　　4.多向分化潛能
　　4.1牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨能力比較及成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)

16、:成骨誘導(dǎo)8天 ALP染色,堿性磷酸酶(AKP)定量測(cè)試分析示:DPSCs的ALP活性強(qiáng)于re-DPCs(P<0.05);成骨誘導(dǎo)4周后,茜素紅染色,十六烷基吡啶定量分析顯示,DPSCs成骨能力略強(qiáng)于re-DPCs,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);RT-PCR及 Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP,COL-I及 RUNX2顯示:DPSCs成骨能力強(qiáng)于 re-DPCs,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而BSP及OCN基因的表達(dá)則

17、無(wú)明顯差異,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣檢測(cè) PDLSCs及 re-PDLCs顯示: re-PDLCs的ALP活性明顯低于 PDLSCs(P<0.001),且成骨能力亦明顯低于PDLSCs(P<0.001);RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、BSP、 OCN、 COL-I和RUNX2顯示: PDLSCs成骨能力強(qiáng)于 re-PDLCs,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　4.2牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓

18、樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成脂能力比較及成脂相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè):成脂分化誘導(dǎo)21天后油紅O染色,脂滴形成面積計(jì)算顯示:DPSCs成脂誘導(dǎo)分化能力略強(qiáng)于re-DPCs,但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成脂相關(guān)基因PPARγ也顯示DPSCs的成脂誘導(dǎo)分化能力略強(qiáng)于re-DPCs,但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同樣方法檢測(cè)PDLSCs和re-PDLCs誘導(dǎo)成脂分化能力顯示

19、:PDLSCs誘導(dǎo)成脂分化能力略強(qiáng)于 re-PDLCs,但兩者亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　4.3牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨分化能力比較及成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè):成軟骨分化誘導(dǎo)8周,HE染色顯示:DPSCs成軟骨分化能力強(qiáng)于re-DPCs(P<0.05);RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成軟骨分化相關(guān)基因COL-II和ACAN顯示,DPSCs成軟骨分化能力強(qiáng)于

20、re-DPCs(P<0.05)。同樣檢測(cè)PDLSCs和re-PDLCs顯示:PDLSCs成軟骨分化能力明顯強(qiáng)于 re-PDLCs(P<0.001)。
　　結(jié)論:
　　1:牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞具有成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化能力,且可以異位再生出類牙髓樣組織和類牙周膜樣組織。
　　2:從再生出的組織中分離出的re-DPCs和re-PDLCs分別與再生前DPSCs和PDLSCs比較發(fā)現(xiàn):re-DPCs和re-PDLCs體