人汗腺細(xì)胞及其誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞的生物學(xué)特征鑒定.pdf

1、排汗是皮膚的重要功能之一，皮膚通過(guò)排汗來(lái)維持基礎(chǔ)代謝體溫。汗腺是皮膚的一個(gè)附屬機(jī)構(gòu)，是排汗的承擔(dān)者，沒(méi)有汗腺的皮膚如疤痕等不能排汗。隨著醫(yī)療衛(wèi)生改革和居民生活水平的提高，大面積深度燒傷病人存活率越來(lái)越高。大面積深度燒傷病人的燒傷面積可達(dá)98%，病人傷愈后，在創(chuàng)面形成疤痕組織，而疤痕組織不含有汗腺，不能排汗，大大影響了病人的生活質(zhì)量。如何再生足夠量的汗腺，使病人皮膚排汗功能修復(fù)，是臨床上亟待解決的問(wèn)題。
　　由于大面積深度燒傷病人的

2、燒傷面積很大，不可能從病人身上取得大量的汗腺細(xì)胞，所以汗腺細(xì)胞的來(lái)源很少，并且汗腺細(xì)胞是體細(xì)胞，在體外難以實(shí)施擴(kuò)增培養(yǎng)。所以本論文旨在通過(guò)體外分離獲得人汗腺細(xì)胞，繼而構(gòu)建人汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS，為獲得大量的修復(fù)汗腺的種子細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分人汗腺細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)及鑒定
　　目的：從外科手術(shù)廢棄的幼兒六指皮膚中分離獲得汗腺細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)傳代方法，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：將幼兒六指皮膚除去脂肪

3、和結(jié)締組織，剪成1mm2大小，用IV型膠原酶于37℃消化4h，在倒置顯微鏡下提取出汗腺。將汗腺干貼于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3d后，細(xì)胞從汗腺中長(zhǎng)出。RT-PCR和免疫熒光染色技術(shù)檢測(cè)汗腺細(xì)胞的標(biāo)志基因和蛋白質(zhì)CEA、CK14和CK18的表達(dá)。
　　結(jié)果：人汗腺細(xì)胞呈典型的上皮細(xì)胞樣生長(zhǎng)，排列緊密，類似鋪石路狀，細(xì)胞邊界明顯，核清晰；RT-PCR和免疫熒光染色技術(shù)結(jié)果顯示，分

4、離培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)汗腺細(xì)胞的標(biāo)志基因和蛋白CEA、CK14和CK18。
　　結(jié)論：成功建立人汗腺細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)體系，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步研究汗腺細(xì)胞奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　第二部分人汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS制備及生物學(xué)特性鑒定
　　目的：重編程人汗腺細(xì)胞為誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析。
　　方法：取體外培養(yǎng)10d后的汗腺細(xì)胞，以1×105的密度接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。第二天，加

5、入含有4種胚胎干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的慢病毒的無(wú)血清培養(yǎng)基。2-3d后，消化接種到鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)約10d后，挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與hESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的24孔板中。培養(yǎng)約10d后，再次挑選克隆和細(xì)胞形態(tài)與hESC相同的克隆，接種于鋪有滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板中。RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)后的細(xì)胞Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanong基因表達(dá)，免疫熒光技

6、術(shù)分析4因子轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)hESC標(biāo)志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）人汗腺細(xì)胞經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)改變，與汗腺細(xì)胞差異顯著，形成的iPS克隆，形態(tài)與hESC形態(tài)相似，細(xì)胞生長(zhǎng)緊密，邊界不明顯，核質(zhì)比高，核仁清新，在細(xì)胞周圍有大量代謝產(chǎn)物；（2）RT-PCR顯示汗腺細(xì)胞來(lái)源的iPS表達(dá)基因Oct4、Sox2、KLf4、c-Myc和Nanog；（3）免疫熒光技術(shù)顯示汗