血小板裂解液(platelet lysate,PL)對牙源性間充質干細胞的生物學影響.pdf

1、血小板裂解液（platelet lysate，PL）是自體或異體血小板富集物經細胞裂解后的產物，已經被諸多研究推薦作為胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）的替代品，應用于間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）的大規(guī)模擴增培養(yǎng)。但是，PL對諸如牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）、牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells

2、，PDLSCs）及根尖牙乳頭干細胞（stem cells from apical papilla，SCAP）等牙源性干細胞的生物學效應尚不明確。本課題在體外分離、培養(yǎng)和鑒定人牙髓干細胞、牙周膜干細胞及根尖牙乳頭干細胞的基礎上，通過比較體內、外不同培養(yǎng)模式下，PL對這三種牙源性干細胞增殖及分化的影響，以期找到PL應用于牙源性干細胞培養(yǎng)、誘導分化的最佳方式，為研究相關機制及組織工程應用提供實驗基礎，同時為將來PL在臨床治療方面的應用提供新的

3、思路。結果如下。
　　1.牙髓干細胞、根尖牙乳頭干細胞和牙周膜干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
　　使用酶消化法或組織塊法分離獲得人原代DPSCs、SCAP和PDLSCs，利用有限稀釋法克隆化培養(yǎng)以純化傳代細胞；采用免疫細胞染色及流式細胞儀鑒定細胞STRO-1等表型，確定所獲細胞的間充質干細胞屬性；采用成脂誘導及成骨/成牙本質誘導驗證細胞的多向分化能力。
　　2.血小板裂解液的制備及相關培養(yǎng)體系的建立
　　使用10人份機

4、采血小板，混合后利用凍融裂解法制得滿足實驗需要的血小板裂解液PL；將PL制成品以一定的體積濃度比加入普通培養(yǎng)基及礦化誘導培養(yǎng)基配制成條件培養(yǎng)液；將擴增培養(yǎng)所獲的牙源性干細胞以平面培養(yǎng)或復合HA-TCP支架培養(yǎng)，營造不同的細胞培養(yǎng)空間環(huán)境。
　　3.血小板裂解液對DPSCs、SCAP和PDLSCs體外增殖、礦化的影響
　　以體外二維平面培養(yǎng)或復合 HA-TCP支架三維培養(yǎng)的DPSCs、SCAP和PDLSCs為靶細胞，研究不同濃

5、度PL對牙源性干細胞增殖及礦化的影響。結果發(fā)現(xiàn)：PL對DPSCs的增殖、成骨/成牙本質分化的干預效應與其在培養(yǎng)體系之中的相對濃度、細胞培養(yǎng)的空間模式密切相關；平面及三維培養(yǎng)模式下，5％PL均能夠顯著促進DPSCs的增殖分化（P＜0.05），同時掃描電鏡及組織學觀察結果顯示，該濃度PL處理組樣本在體外三維培養(yǎng)至第14天時，能夠形成大量膠原纖維包繞于細胞膜片-支架材料復合體表面；而對于體外三維培養(yǎng)模式下的SCAP和PDLSCs，5％PL同樣

6、能夠顯著促進細胞增殖及礦化基質的形成，并有助于在支架材料上形成完整的細胞膜片樣結構，且PDLSCs對于以上效應的應答更為顯著，同時SCAP在培養(yǎng)至第7天時，即形成大量膠原纖維包裹于細胞膜片-支架材料復合體表面。
　　4.血小板裂解液對DPSCs、SCAP和PDLSCs的體內組織再生能力的影響
　　體內研究結果發(fā)現(xiàn)：將經不同濃度PL體外培養(yǎng)14天的DPSCs/HA-TCP支架復合體植入裸鼠背部皮下12周后，發(fā)現(xiàn)PL處理組具有更

7、強的體內構建硬組織能力（P＜0.05），而5％PL能夠顯著提高DPSCs在人離體牙根管腔內再生牙體組織的能力；SCAP及PDLSCs經不同濃度PL培養(yǎng)后，以細胞膜片形式復合HA-TCP支架材料植入裸鼠背部皮下8周后即可分別形成特征性的牙髓牙本質復合體樣結構、牙周膜/牙骨質樣結構。
　　綜上所述，本研究認為一定體積濃度比的PL在DPSCs、SCAP及PDLSCs等牙源性干細胞體內外增殖、定向分化中可能起到促進作用，在牙組織工程領域具