自體肌源性干細(xì)胞注射治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、壓力性尿失禁(stressurinaryincontinence，SUI)是指患者腹壓突然增加(咳嗽、大哭、噴嚏、運動及體位改變)時，尿液不自主地由尿道口流出的現(xiàn)象。尿失禁是是影響女性尤其是中老年女性生活質(zhì)量的主要疾病之一。隨著社會進(jìn)一步老齡化，SUI越來越受到人們的重視。 SUI主要治療措施包括非手術(shù)治療和手術(shù)治療。非手術(shù)治療主要是包括改變生活方式、盆底肌鍛煉、行為療法、生物反饋電刺激治療、藥物治療等，適用于癥狀較輕的患者及年

2、輕女性，使用范圍較窄。手術(shù)治療主要包括經(jīng)陰道尿道膀胱頸筋膜縫合術(shù)、經(jīng)恥骨后膀胱尿道懸吊術(shù)、無張力陰道懸?guī)g(shù)等。傳統(tǒng)的膀胱頸懸吊術(shù)及其改良手術(shù)方法通過膀胱頸懸吊以改變膀胱頸和尿道的角度，治療Ⅰ、Ⅱ型SUI取得較好的效果。但手術(shù)創(chuàng)傷較大，懸吊力度不易掌握，可出現(xiàn)矯枉過正而致尿潴留，且不能糾正部分SUI患者的括約肌功能障礙。注射療法是將藥物或化學(xué)制劑注射到后尿道或膀胱內(nèi)口周圍粘膜下及肌層中，使尿道腔變窄、拉長和縮小，可不同程度彌補固有括約肌的

3、功能不足，增加尿道阻力，從而改善壓力性尿失禁癥狀。近幾年，注射療法以其簡便、安全、微創(chuàng)的特點而逐漸受到醫(yī)生及病人的重視和歡迎。 注射療法常用注射材料有Teflon(特氟隆)、膠原、自體脂肪、硅樹脂顆粒、碳珠和微球體等。其近期療效較好，但遠(yuǎn)期療效逐漸降低，且上述注射材料具有明顯的副反應(yīng)。尋找高效、長效、安全的注射材料，是SUI臨床治療的迫切需要。理想的注射材料應(yīng)該在結(jié)構(gòu)上完整；無毒、無免疫原性；對局部組織僅引起輕微的炎癥反應(yīng)；顆粒

4、直徑應(yīng)足夠大(＞110um),不會被巨噬細(xì)胞吞噬而轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處器官；近期內(nèi)不會被分解，在足夠長的時間內(nèi)能保持其支撐作用。骨骼肌肌源性干細(xì)胞(musclederivedstemcells，MDSCs)具有向肌肉、脂肪、骨骼、軟骨和神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞分化的潛能，且來源豐富，可在體外分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增，是一種良好的替代治療靶細(xì)胞。利用自體MDSC進(jìn)行注射治療，具有安全、無免疫排斥性、無過敏原性等優(yōu)點，相信在不遠(yuǎn)的將來可能會為壓力性尿失禁提供新的治

5、療選擇。 本研究采用成年雌性SD大鼠為實驗動物并制作了SUI動物模型，從骨骼肌分離、純化和培養(yǎng)肌源性干細(xì)胞，觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，應(yīng)用免疫組化技術(shù)以及形態(tài)觀察對MDSC進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定。通過向大鼠SUI動物模型的尿道周圍注射自體MDSC，觀察了注射前后動物模型尿失禁改善情況以及自體MDSC注射后的存活情況。主要實驗方法及結(jié)果如下： 一、MDSC的分離、純化和培養(yǎng) 1.MDSC的分離和培養(yǎng)：SD大鼠腓腸肌肌塊經(jīng)消化分

6、離后獲得混合細(xì)胞產(chǎn)物；使用percoll密度梯度離心法和preplate差速貼壁純化MDSC。觀察見MDSC體積較小，貼壁緩慢，折光性較好，多呈球形、梭形或紡錘形，增殖緩慢；MDSC培養(yǎng)72h后，細(xì)胞數(shù)量明顯增多并均勻散在分布，以紡錘形及梭狀為主，少數(shù)形態(tài)不規(guī)則；培養(yǎng)5～7d后，細(xì)胞分裂增殖明顯，細(xì)胞密度明顯增加，胞體逐漸舒展，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞呈長梭形、長棱形地貼壁生長；培養(yǎng)12～14d，貼壁細(xì)胞繼續(xù)增殖，細(xì)胞密度增大，并逐漸融合；分

7、化培養(yǎng)8-12d，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯極向性生長排列趨勢，可見明顯肌管形成。 2.不同接種密度對MDSC生長的影響：采用MTT比色法，分別以下列不同接種密度：2、4、6、8、10、12、14、16(×105/ml)接種100ulMDSC于含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。結(jié)果顯示在以10×105/ml密度接種時活細(xì)胞數(shù)量最多，細(xì)胞活性較好，有利于MDSC的生長。故以10×105/ml為適宜接種密度，進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

8、 3.MDSCs的傳代培養(yǎng)：MDSCs在穩(wěn)定培養(yǎng)14-16天后，細(xì)胞密度顯著增加并逐漸融合，以10×105/ml為接種密度，予以傳代培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞呈長梭形和紡錘形為主，傳1-4代細(xì)胞分裂增殖明顯，適宜行細(xì)胞注射實驗。隨著傳代次數(shù)增多，細(xì)胞增殖速度逐漸減慢。傳代細(xì)胞培養(yǎng)到第7代，細(xì)胞仍然存活。 4.骨骼肌MDSC的鑒定：MDSC經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光染色鑒定，結(jié)果為desmin(+)，CD34(+)，Sca-1(+

9、)，CD45(-)；肌管skeletalmyosin(fast)免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈強陽性反應(yīng)。 本部分研究提示，通過消化分離，percoll密度梯度離心和preplate差速貼壁技術(shù)，可以獲得純度較高的SD大鼠MDSC；在適宜的培養(yǎng)條件以及接種密度情況下細(xì)胞顯現(xiàn)出最佳的生長增殖狀態(tài)，并可穩(wěn)定傳代培養(yǎng)；MDSC免疫細(xì)胞化學(xué)染色和免疫熒光染色鑒定結(jié)果為desmin(+)，CD34(+)，Sca-1(+)，CD45(一)。 二

10、、大鼠SUI動物模型的制作和MDSC標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)染 1.大鼠SUI動物模型的制作：以雙側(cè)陰部神經(jīng)阻斷的方法，制備大鼠SUI動物模型。尿動力學(xué)檢測提示模型動物的最大膀胱容量，LPP和CP均較正常顯著下降；噴嚏負(fù)荷實驗陽性率100％，證實SUI動物模型制作成功。 2.MDSC標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)染：使用攜帶LacZ基因的重組AAV2載體rAAV2-LacZ，在丁酸鈉的輔助作用下轉(zhuǎn)染MDSC，行β-半乳糖苷酶原位染色觀察見大量細(xì)胞呈藍(lán)

11、染，轉(zhuǎn)染效率達(dá)80％以上，證明轉(zhuǎn)染成功。 本部分研究通過雙側(cè)陰部神經(jīng)阻斷的方法，成功建立了SUI的動物模型，為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。該模型具有操作簡便，制作成功率高，仿真度高，順應(yīng)性好等優(yōu)點。本實驗使用重組AAV2載體rAAV2-LacZ，成功高效地轉(zhuǎn)染了MDSC，使其表達(dá)β-半乳糖苷酶，在X-gal染色作用后呈現(xiàn)明顯藍(lán)染；該方法簡單易行，為長期觀測MDSC的體內(nèi)狀況創(chuàng)造了條件。 三、自體MDSC注射對雌性大鼠SUI的影響

12、 1.MDSC自體注射：將自體MDSC50ul(約1×106個)，注射到細(xì)胞來源的SUI模型動物的尿道近端肌層及黏膜下，使局部隆起。 2.MDSC自體注射對大鼠SUI的影響：與注射前相比，大鼠MDSC細(xì)胞注射后最大膀胱容量、LPP、CP均有顯著上升，噴嚏負(fù)荷實驗陽性率下降顯著，提示自體MDSC注射有效改善SUI癥狀。組織切片檢查提示，注射細(xì)胞在局部并未引起明顯慢性炎癥及免疫排斥反應(yīng)；注射后8w仍有報告基因表達(dá)，提示自體M