大鼠肌源細胞自體移植治療尿道括約肌損傷尿失禁的實驗研究.pdf

1、目的： 尿失禁是一種排尿自禁功能障礙性疾病，國際尿控協(xié)會(Intenlational Continence Society，ICS)定義為不能由意志控制的流尿現(xiàn)象，隨著人口老齡化進程的加重，其發(fā)病率越來越高，UI雖然不危及患者的生命，但嚴重影響患者的生活質量。多數(shù)統(tǒng)計認為男性外傷或前列腺術后尿失禁的發(fā)病率為3％-40％，治療上非常棘手。尿道固有括約肌結構及功能缺陷(intrinsic sphincter deficiency，I

2、SD)是導致UI的關鍵機制之一，雖然正常機體存在成肌作用，但尿道括約肌的再生能力有限，所以患者存在明顯的成肌功能障礙。男性外傷或前列腺術后UI的治療方法眾多，包括非手術治療和手術治療，非手術治療包括藥物治療、盆底肌鍛煉、生物反饋、電刺激、行為治療等，療效較差，外科手術治療方法有：人工尿道括約肌植入術、球部尿道海綿體懸吊術、尿道粘膜下注射等。類似女性尿失禁，其中早期尿道粘膜下注射填充物質是治療由ISD導致UI的有效方法之一，由于注射治療具

3、有安全、簡便、微創(chuàng)的特點而逐漸受到醫(yī)生和患者的重視和歡迎。目前常用的注射材料有特氟隆、膠原、自體脂肪、硅顆粒等，雖然近期療效好，但遠期效果不佳。理想的注射材料應該是安全、高效、持久、無免疫原性、不發(fā)生遷移。 隨著細胞組織工程的發(fā)展，人們利用細胞具有多潛能再生能力和可塑性的特點通過注射治療恢復、替代和修復受損組織和器官，相關的基礎研究已經廣泛地開展。人們對骨骼肌細胞的生物學行為研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌內包含的成肌細胞(myoblast)，

4、通常情況下處于靜止狀態(tài)，肌肉損傷時能夠分裂增殖，而肌源細胞(muscle derived cell，MDC)的分裂能力更強，它含有衛(wèi)星細胞(satellite cell)，后者具有干細胞的特征。類似的研究如治療心肌梗塞，骨骼肌MDC心肌內注射后能長期存活并可改善心臟功能，而下尿路功能障礙，尤其是尿失禁病變位置表淺，易于注射，與其它材料相比，MDC是自身組織材料，不存在組織相容性問題，亦不怕注射物的遠處轉移。本實驗應用大鼠尿道括約肌損傷尿

5、失禁動物模型，肌源細胞自體移植，觀察對括約肌損傷尿失禁的治療作用，為MDC自體移植治療尿失禁在臨床上的應用提供實驗依據(jù)。 材料和方法： 1．大鼠MDC的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定和轉染： 取成年健康SD大鼠，分離肌肉細胞后，膠原酶、分解酶及胰蛋白酶消化細胞，用鼠尾膠原鋪被培養(yǎng)瓶，采用差速貼壁技術，按細胞貼壁的快慢將肌細胞分為PP1-PP6。培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1h，貼壁的細胞為PP1；未貼壁的細胞懸液轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2h

6、，貼壁的細胞為PP2;未貼壁的細胞懸液再轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)18h，貼壁的細胞為PP3；未貼壁的細胞懸液轉入另一培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24h，貼壁的細胞為PP4)此過程重復(間隔24h)至PP6。貼壁細胞原代培養(yǎng)后傳代培養(yǎng)，α-骨骼肌肌動蛋白對PP1-PP6細胞及分化后的肌管進行鑒定。用熒光染料Hoechst33258標記第二代PP5、PP6細胞。 2．用燒灼尿道中段括約肌的方法建立大鼠尿失禁動物模型，通過尿道置管尿動力學檢查和噴嚏實驗檢

7、驗動物模型的陽性率。用成功建立尿失禁的動物分組，注射組12只，照上述方法制取MDC，并轉染Hoechst33258作標記，尿道注射；假注射組12只，DMEM培養(yǎng)基尿道注射；正常大鼠對照組6只，剖腹暴露尿道而不注射物質。注射組和假注射組在1、7、14、30天每組各取3只大鼠處死，制作尿道組織切片，觀察注射細胞的生長情況和組織變化；三組于注射后1周、2周各取3只大鼠行尿動力學檢查，從形態(tài)和功能上評估尿失禁的治療效果。 結果：

8、 1．通過差速貼壁技術獲得肌源細胞，PP1、PP2細胞貼壁迅速，數(shù)量多，PP3以后數(shù)量減少，PP5、PP6數(shù)量更少，原代培養(yǎng)PP6細胞48小時后仍為圓形，72小時后開始貼壁，細胞由圓形變?yōu)樗笮?，體積增大，傳代培養(yǎng)3代內細胞分布均勻，分裂旺盛，7代后細胞生長緩慢，變形裂解開始脫壁。分化培養(yǎng)后可見明顯的肌管形成。 2．免疫組織化學鑒定：α-骨骼肌肌動蛋白染色肌源細胞呈陽性，且PP1-PP6陽性率逐漸增高，在肌管為強陽性。這表明PP1、PP2

9、主要是成纖維細胞，PP3以后肌源細胞含量逐漸增高，PP5、PP6為主要肌源細胞，并具有干細胞的特征。 3．MDC的標記：熒光顯微鏡下，Hoeehst33258染色的活細胞核呈藍色，淺染，圓形，邊界規(guī)則整齊，而凋亡細胞核內DNA濃聚，核碎裂，表現(xiàn)為體積明顯縮小的深染核形態(tài)。 4．尿失禁動物模型：燒灼尿道中段括約肌后，尿道置管尿動力學檢查漏尿點壓下降，噴嚏實驗陽性率89％，表明尿失禁動物模型建立成功。 5．Hoech

10、st33258標記的MDC注射治療：MDC制取并標記后，注射到細胞來源大鼠的尿道，并設立對照組。結果發(fā)現(xiàn)，注射后1天，細胞保持小圓形，局限于注射部位，14天左右熒光細胞呈長梭形，分布擴大，提示移植細胞在尿道內發(fā)生了有限的遷移，14后，部分熒光細胞逐漸變弱，一部分細胞失去正常的形態(tài)，提示移植細胞部分分化和融合，局部種植。 6．恥骨上置管尿動力學檢查：腹壓漏尿點壓(ALPP)在注射組、假注射組、對照組注射后一周三組分別為：20.48

11、±1.08cmH2O、16.30±0.40cmH2O、24.46±0.35cmH2O(F=33.35，P<0.01)，注射后兩周三組分別為：22.36±0.64cmH2O、18.44±0.80cmH2O、25.44±0.58cmH2O(F=59.58，P<0.01)，三組比較差異具有統(tǒng)計學意義，兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。MDC注射后能顯著提高大鼠的ALPP，噴嚏實驗陽性率顯著下降，注射MDC組效果優(yōu)于注射無血清培養(yǎng)基DM

12、EM組，但與未注射組相比，注射MDC的尿失禁大鼠的控尿能力并不能完全恢復到正常。 結論： 1．采用差速貼壁技術和酶消化法可以成功分離、純化培養(yǎng)MDC。 2．α-骨骼肌肌動蛋白可以對骨骼肌MDC和肌管進行鑒定。 3．燒灼尿道中段括約肌的方法可以成功建立大鼠尿失禁動物模型。 4．熒光燃料Hoechst33258可以標記MDC。 5．大鼠尿道括約肌損傷后近期MDC注射，可修復替代損傷的括約肌細胞