骨髓間充質(zhì)干細胞治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、研究背景：干細胞可用于治療女性壓力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)，而且目前正在進行有關(guān)的臨床試驗。然而，干細胞治療的作用機制并未闡明。
　　目的：本研究的目的是檢測骨髓間充質(zhì)干細胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BM-MSC）及其分泌物對模擬產(chǎn)傷動物模型功能及結(jié)構(gòu)的恢復(fù)作用。
　　方法：1、成年雌性大鼠BM-MSC獲取及定向分化

2、能力檢測。濃縮分泌物(Concentrated conditioned media，CCM)的獲取及微陣列蛋白檢測；2、模擬產(chǎn)傷動物模型的制備，包括陰道擴張(Vaginal distention，VD)和雙側(cè)陰部神經(jīng)擠壓(Pudendal nerve crush，PNC)；3、大鼠試驗包含兩個部分，第一部分含有三個組，分別是假損傷+生理鹽水尾靜脈注射（n=15），雙重損傷+生理鹽水尾靜脈注射(n=13)，和雙重損傷+BM-MSC尾靜脈注

3、射(n=16)。第二部分含有三個組,分別是假損傷+濃縮普通培養(yǎng)基(concentrated control media，CM)腹腔注射（n=18），雙重損傷+CM腹腔注射(n=19)，和雙重損傷+CCM腹腔注射(n=17)。手術(shù)三周后進行功能學(xué)及組織學(xué)檢測，功能學(xué)檢測包括漏尿點壓力(Leak point pressure，LPP)，尿道外括約肌(External urethral sphincter，EUS)肌電圖(Electromyo

4、graphy，EMG)，和陰部神經(jīng)感覺支神經(jīng)電位(Pudendal nerve sensory branch potential，PNSBP)檢測。組織學(xué)檢測包括彈性纖維蛋白染色，神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)和陰部神經(jīng)免疫熒光染色。
　　結(jié)果：1、從成年雌鼠股骨中獲取的骨髓在低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，到第三代(Passage3，P3)時利用流式細胞儀分選細胞間黏附分子-1(Intracelluar

5、adhesion molecule，ICAM-1)陽性的MSC，然后使用綠色熒光蛋白(Green fluroscence protein，GFP)慢病毒載體感染MSC。體外培養(yǎng)的MSC用光鏡觀察主要呈梭形和多角形，連續(xù)傳代P8和P16后用流式細胞儀進行細胞表面標(biāo)志檢測發(fā)現(xiàn)CD29，CD90，CD54和CD45等干細胞標(biāo)志物表達均呈陽性，P16細胞進行脂肪形成和成骨形成定向分化檢測，脂肪形成培養(yǎng)到20-35天后用茜素紅S染色觀察分化程度，

6、成骨形成20-35天后用油紅O和蘇木紫染色觀察分化程度。P16骨髓間充質(zhì)干細胞在無血清DMEM普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，使用低氧、5％CO2、37℃培養(yǎng)箱。將獲得的上清液提取出來，置于離心過濾器中并在離心機中4000rpm離心75分鐘獲得濃縮50倍的終產(chǎn)物，然后用0.22um過濾器過濾獲取的CCM并儲存在1.5ml離心管中。CM使用無血清DMEM離心濃縮獲得，方法類似。CCM在注射前進行細胞計數(shù)和誘導(dǎo)分化試驗，結(jié)果顯示CCM中沒有細胞存在

7、并且使用CCM培養(yǎng)的MSC生長速度要顯著高于對照組。使用RayBio?大鼠蛋白抗體陣列檢測CCM中的蛋白組成發(fā)現(xiàn)了63種不同表達強度的細胞因子和趨化因子。
　　2、VD+PNC雙重損傷延遲了陰部神經(jīng)和尿道的功能恢復(fù)，其中LPP，EUS EMG結(jié)果顯示到第三周時雙重損傷組顯著低于對照組，而VD和PNC單獨損傷組與對照組相比均無顯著差異，陰部神經(jīng)橫斷(Pudendal nerve transection，PNT)組在損傷第六周時LPP

8、和EUS EMG仍顯著低于對照組?；谝陨辖Y(jié)果我們使用VD+PND雙重損傷模型作為本實驗研究模型。
　　3、雙重損傷+生理鹽水或CM注射組在第三周時LPP顯著低于對照組，說明尿道功能損傷和抗漏尿壓力降低。而接受MSC或CCM注射的雙重損傷大鼠三周后的LPP與對照組相比無顯著差異，說明MSC和CCM均能促進尿道功能恢復(fù)。EUS EMG振幅增加值（峰值-基礎(chǔ)值）在雙重損傷接受生理鹽水或MSC注射治療后均顯著低于對照組，EUS EMG振

9、頻和振幅增加值在其他各組中相比均無明顯差別，說明MSC和CCM并未促進EUS EMG的恢復(fù)。PNSBP振頻和振幅增加值（峰值-基礎(chǔ)值）在雙重損傷+生理鹽水或CM注射組均顯著低于對照組，而MSC或CCM注射組與對照組相比并無明顯差別，說明MSC和CCM均能促進模擬產(chǎn)傷后的神經(jīng)功能恢復(fù)。組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，雙重損傷三周后尿道外括約肌橫紋減少并且有肌肉萎縮現(xiàn)象。彈性纖維在對照組中表現(xiàn)為連續(xù)的長纖維，主要出現(xiàn)在尿道外括約肌外層，與括約

10、肌平行。雙重損傷三周后這些平行于括約肌的外層長纖維破壞并糾纏在一起，而括約肌內(nèi)側(cè)的彈性纖維增加并與括約肌垂直。而MSC或CCM注射組在括約肌內(nèi)側(cè)觀察到更多的新生彈性纖維，說明MSC和CCM均能誘導(dǎo)彈性纖維的合成。尿道NMJ免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)對照組中陰部神經(jīng)軸突呈長直狀，所支配的運動終板呈單個聚集狀，且支配較好。雙重損傷三周后，接受生理鹽水或CM注射組的陰部神經(jīng)軸突較細，所支配的運動終板無序且呈擴散狀，神經(jīng)支配較差。而雙重損傷三周后，接受M

11、SC或CCM注射組的陰部神經(jīng)出現(xiàn)多個側(cè)支，運動終板的無序和擴散程度較輕，說明MSC和CCM提高了神經(jīng)肌肉接頭的恢復(fù)。陰部神經(jīng)免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，對照組中神經(jīng)纖維呈緊湊環(huán)狀，排列整齊。雙重損傷三周后，接受生理鹽水或CM注射組的神經(jīng)纖維密度降低且形狀不規(guī)則。而雙重損傷三周后接受MSC或CCM注射組可同時發(fā)現(xiàn)正常和非正常的神經(jīng)纖維，且其密度要高于前者，說明促進了神經(jīng)的恢復(fù)再生。GFP免疫熒光染色并未在尿道和陰道組織中發(fā)現(xiàn)GFP標(biāo)記的MSC。

12、r>　　結(jié)論：1、從雌性大鼠骨髓中獲取的間充質(zhì)干細胞可在體外成功培養(yǎng)。GFP慢病毒載體成功感染MSC，這為后續(xù)的MSC體內(nèi)定位研究提供了條件。利用高速離心可獲得濃縮的MSC分泌物，蛋白質(zhì)陣列分析發(fā)現(xiàn)了多種細胞因子和蛋白質(zhì)，這為闡明干細胞治療SUI提供了新的思路。2、雙重損傷延遲了組織和功能的恢復(fù)，該模型可用于慢性SUI的研究。3、MSC和CCM均能促進尿道功能和神經(jīng)的恢復(fù)，其作用主要通過纖維蛋白增加和神經(jīng)肌肉功能恢復(fù)。該研究證明無需細胞