肌源性干細(xì)胞治療壓力性尿失禁的實驗研究.pdf

1、女性壓力性尿失禁(SUI)是指在腹壓突然增加時出現(xiàn)無法控制的漏尿，SUI是一種婦科常見疾病，隨人口老年化加重，其發(fā)病率越來越高。控尿的主動機制由膀胱頸部、尿道括約肌和尿道肌肉組織的主動收縮完成，這些肌肉的主動收縮產(chǎn)生使膀胱出口關(guān)閉的壓力。導(dǎo)致SUI的關(guān)鍵機制主要有兩種，尿道固有括約肌結(jié)構(gòu)及功能缺陷和膀胱頸支撐功能障礙。其中尿道固有括約肌缺陷(ISD)是導(dǎo)致女性SUI的重要原因，特別是老年女性，幾乎都有括約肌異常的因素。在女性，造成尿道括

2、約肌功能缺陷的最主要原因是年老和產(chǎn)傷，分娩創(chuàng)傷和其他尿失禁的誘發(fā)因素，可使得支配相關(guān)肌肉的神經(jīng)受到損害或肌肉本身損傷，從而使盆底肌和括約肌的質(zhì)量和數(shù)量發(fā)生改變。正常機體局部肌肉組織損傷后會發(fā)生組織再生，由肌肉組織內(nèi)的成肌細(xì)胞再生，以修復(fù)損傷的肌肉組織，但尿道括約肌的再生能力有限，在ISD患者存在有明顯的成肌功能障礙。 SUI的治療方法眾多，包括手術(shù)治療和非手術(shù)治療，由于這些方法均僅解決膀胱頸支撐功能障礙，不能糾正ISD，因此長期

3、療效不理想，且并發(fā)癥多。特別是對由于ISD所致的SUI，由于成肌功能障礙的存在，傳統(tǒng)的治療方法療效更差，從本質(zhì)上改善ISD的治療方法是糾正其成肌功能障礙，即恢復(fù)ISD所致SUI患者成肌細(xì)胞作用或功能。最直接的方法就是采用成肌干細(xì)胞移植進行細(xì)胞治療。 細(xì)胞治療的目的是旨在利用多潛能干細(xì)胞的再生能力和可塑性以恢復(fù)丟失或患病的組織，替代、修復(fù)或增強受損組織或器官的生物學(xué)功能。由于肌肉干細(xì)胞來源容易，以肌肉干細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療研究得到廣泛

4、開展，包括骨骼肌損傷、心肌和平滑肌損傷等，已有成功用于臨床的研究報道。目前一些研究報道骨骼肌成肌細(xì)胞尿道內(nèi)注射移植后能在尿道括約肌長期存活并可改善尿控功能。但是成肌細(xì)胞移植存在許多問題，包括移植后細(xì)胞存活率低下以及增殖能力不強，這些均限制了衛(wèi)星細(xì)胞移植治療的應(yīng)用。MDSCs是肌肉內(nèi)高度未分化的多潛能干細(xì)胞，具有增殖快、融合慢、多分化潛能等特性，移植后存活率高等特點，是一種理想的細(xì)胞移植物。 由于MDSCs數(shù)量極少，因此MDSCs

5、的分離和體外培養(yǎng)是MDSCs移植的關(guān)鍵，目前尚無MDSCs體外培養(yǎng)研究報道。MDSCs在體外和體內(nèi)均具有多分化潛能，其分化和生存均受微環(huán)境的影響，實驗所采用的動物、模型的建立方法以及細(xì)胞的注射時機等均影響移植MDSCs的存活和分化。但目前尚無MDSCs移植至接近人SUI病理生理狀態(tài)模型的研究報道。 本研究在體外通過改良差速貼壁技術(shù)分離MDSCs，在MDSCs上轉(zhuǎn)染pEGFP-N1作標(biāo)記，將MDSC移植至SUI大鼠的近端尿道，檢測

6、了MDSCs移植后體內(nèi)形態(tài)和分布以及尿動力學(xué)變化，為壓力性尿失禁干細(xì)胞移植治療提供理論基礎(chǔ)。主要實驗方法及研究結(jié)果如下： 一、MDSCs分離、培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染： 1、本研究采用改良差速貼壁技術(shù)，對既往報道的分離技術(shù)進行了改進：1、取新生大鼠肌肉標(biāo)本分離細(xì)胞。2、減少貼壁次數(shù)。發(fā)現(xiàn)，將6步貼壁減少至5步，而維持總的貼壁時間不變，分離得到的細(xì)胞數(shù)量相對增加，細(xì)胞為小圓形，結(jié)蛋白染色陽性，與6步貼壁法分離得到MDSCs一致，提示分離

7、得到的細(xì)胞為MDSCs。采用5步貼壁分離技術(shù)有以下優(yōu)點：(1)、簡化了實驗步驟。(2)、增加了MDSCs的量。 2、MDSCs培養(yǎng)：本課題發(fā)現(xiàn)，MDSCs原代培養(yǎng)48小時后開始增殖，在原代培養(yǎng)6～8天后細(xì)胞數(shù)量明顯增加，出現(xiàn)較多的長梭形細(xì)胞，提示出現(xiàn)成纖維細(xì)胞混雜。傳代后成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，但在傳代細(xì)胞培養(yǎng)4～5天后，培養(yǎng)的細(xì)胞中又出現(xiàn)成纖維細(xì)胞，并逐漸增多。在傳代細(xì)胞培養(yǎng)的第6～7天采用消化法對MDSCs進行純化，可顯著

8、減少成纖維細(xì)胞。 3、MDSCs結(jié)蛋白染色：取第三代細(xì)胞行結(jié)蛋白免疫熒光檢測，熒光顯微鏡下見MDSCs的胞漿表達有綠色熒光。 二、壓力性尿失禁模型建立和MDSC移植治療 1、壓力性尿失禁模型建立：本研究通過雙側(cè)坐骨神經(jīng)橫斷術(shù)建立SUI模型，發(fā)現(xiàn)在坐骨神經(jīng)橫斷后2周，LPP顯著下降，提示尿道固有括約肌尿控功能下降，尿道組織學(xué)檢查示尿道周圍肌肉有萎縮，所建立的模型同時有尿道括約肌結(jié)構(gòu)和功能缺陷，類似于人ISD。

9、 2、MDSCs移植治療：通過在MDSCs上轉(zhuǎn)染pEGFP-N1作標(biāo)記，系統(tǒng)檢測了MDSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠近端尿道周圍后細(xì)胞的分化和分布，通過測定漏尿點壓力檢測了MDSCs移植后尿控功能變化。發(fā)現(xiàn)，MDSCs移植后第7天和第14天，LPP均得到顯著提高，提示尿道括約肌功能得到改善。但MDSCs移植不能完全恢復(fù)LPP，說明MDSCs移植不能完全恢復(fù)ISD。在移植后第一天和第三天，MDSCs保持小圓形和橢圓形，局限于注射部位。

10、移植后第七天，一部分強熒光細(xì)胞呈長梭形，熒光細(xì)胞的分布較前擴大，但局限于尿道周圍肌肉內(nèi)，提示移植后第7天一部分MDSCs開始分化，并在尿道周圍發(fā)生了有限的遷移。移植后第10天，部分強熒光細(xì)胞呈長梭形，一部分失去正常細(xì)胞形態(tài)，提示移植的MDSCs部分分化為肌細(xì)胞，部分死亡。在移植后第14天，熒光細(xì)胞中部分呈長梭形，未見圓形細(xì)胞，提示除已分化成肌纖維的MDSCs外，其余MDSCs變性。結(jié)果提示MDSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠后能存活、分

11、化而整合至宿主尿道括約肌，改善壓力性尿失禁大鼠的尿控功能。 總之，通過改良差速貼壁技術(shù)可成功從新生大鼠分離MDSCs。在MDSCs體外培養(yǎng)時有成纖維分化趨勢，采用消化法傳代并在培養(yǎng)過程中采用消化法純化可以減少成纖維細(xì)胞，提高MDSCs的純度。將轉(zhuǎn)染有pEGFP-N1的MDSCs移植至SUI大鼠近端尿道后，漏尿點壓力得到顯著提高，尿道括約肌的尿控功能得到明顯改善。移植的MDSCs存活并分化而整合至尿道括約肌，本研究為MDSCs移植