脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療壓力性尿失禁的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究在體外通過(guò)改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)分離ADSCs并標(biāo)記，體外定向誘導(dǎo)ADSCs分化為成肌細(xì)胞。將ADSC移植至SUI大鼠的近端尿道，檢測(cè)了ADSCs移植后體內(nèi)形態(tài)和分布以及尿動(dòng)力學(xué)變化，及尿道及其周?chē)M織形態(tài)學(xué)改變，觀察間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療壓力性尿失禁大鼠是否有效可行，為壓力性尿失禁的組織工程學(xué)治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：⑴采用改良兩步酶消化法結(jié)合差速貼壁技術(shù)分離ADSCs，對(duì)連續(xù)傳代細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并描繪生長(zhǎng)曲

2、線；收集P3細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞術(shù)鑒定及成脂、成骨定向分化功能鑒定；⑵以攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的慢病毒載體系統(tǒng)作為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的媒介對(duì)ADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染。⑶選用第2代ADSCs，經(jīng)5—氮雜胞苷體外定向向成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化。在倒置顯微鏡、透射電鏡下及激光共聚焦顯微成像下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)和超微結(jié)構(gòu)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)對(duì)誘導(dǎo)前后細(xì)胞進(jìn)行Desmin檢測(cè)，采用RT-PCR和Western Blot方法對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞sarcomeric、Des

3、min基因mRNA和蛋白表達(dá)的檢測(cè)。⑷以雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法，制備大鼠SUI動(dòng)物模型。模擬人體尿動(dòng)力學(xué)檢查的方法，測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最大膀胱容量(MBV)、腹壓漏尿點(diǎn)壓(ALPP)、最大尿道閉合壓(MUCP)、能性尿道長(zhǎng)度(FUL)各項(xiàng)指標(biāo)，證實(shí)SUI動(dòng)物模型制作成功。并通過(guò)HE染色、Masson特殊染色、Mallory特殊染色、電鏡超微結(jié)構(gòu)對(duì)大鼠尿道橫紋肌性括約肌的顯微解剖進(jìn)行研究。⑸將建模成功的33只大鼠分成ADSCs移植治療組和培養(yǎng)

4、基注射對(duì)照組，以5×106個(gè)細(xì)胞/只的細(xì)胞數(shù)移植注射到大鼠尿道中下段3、9、12點(diǎn)。移植2周后進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，評(píng)價(jià)動(dòng)物尿動(dòng)力學(xué)變化情況。通過(guò)HE染色、Masson染色、Mal1ory染色及對(duì)尿道評(píng)價(jià)細(xì)胞移植后尿道周?chē)M織病理變化。同時(shí)對(duì)橫紋肌性括約肌的超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)變化觀察及采用肌肉分割法評(píng)估干細(xì)胞治療后控尿系統(tǒng)的修復(fù)。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察移植細(xì)胞存活情況，以及采用二次諧波(SHG)成像技術(shù)探測(cè)尿道周?chē)鶶HG峰值信號(hào)，定量評(píng)價(jià)膠

5、原蛋白含量的變化。
　　 結(jié)果：①體外培養(yǎng)的ADSCs主要呈梭形和多角形，細(xì)胞表達(dá)CD44、CD90，不表達(dá)CD34、CD45、CD106；細(xì)胞成脂、成骨定向分化誘導(dǎo)后油紅-O染色、茜素紅染色陽(yáng)性。倒置相差熒光顯微鏡下，GFP轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs發(fā)出綠色熒光，熒光強(qiáng)度隨MOI值的增加而增強(qiáng)，但以MOI為8的病毒感染大鼠ADSCs熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，傳至P3時(shí)GFP陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)82％-86％。②ADSCs經(jīng)5-Aza等誘導(dǎo)分化后其形態(tài)發(fā)生改

6、變，細(xì)胞大小不一致；在透射電鏡、激光共聚焦顯微成像系統(tǒng)下觀察到，逐漸山長(zhǎng)梭形變?yōu)槎嘟切渭靶切?，?xì)胞表面有許多微絨毛；細(xì)胞器豐富，胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)豐富的線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，胞漿內(nèi)可見(jiàn)肌絲樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)后細(xì)胞表達(dá)結(jié)蛋白Desmin。RT-PCR、Western Blot結(jié)果證實(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)蛋白Desmin基因的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)。⑨雌性SD大鼠的尿道為一長(zhǎng)約2.0 cm的管狀結(jié)構(gòu)。其組織結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次為環(huán)形橫紋肌層、環(huán)形平滑肌層、

7、縱行平滑肌層、致密結(jié)締組織層和上皮層。雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法能成功制造大鼠SUI模型。尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)結(jié)果：模型建立后大鼠膀胱最大容量增加(0.89±0.04)ml(P＜0.01)，腹壓漏尿點(diǎn)壓下降(15.46±5.49)cmH2O(P＜0.01)，最大尿道閉合壓和功能性尿道長(zhǎng)度亦下降(7.97±3.25)cmH2O、(0.69±0.32)cm(P＜0.01)。建模后尿道及其周?chē)M織形態(tài)學(xué)觀察：括約肌排列松散，部分肌肉有斷裂現(xiàn)象，肌層變薄；

8、結(jié)締組織所占比重增加，膠原纖維稀疏，排列紊亂。④尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)ADSCs移植后尿控功能變化，ADSCs治療后大鼠膀胱最大容量下降(0.78±0.35)ml，腹壓漏尿點(diǎn)壓增加(15.06±4.36)cmH2O，最大尿道閉合壓和功能性尿道長(zhǎng)度亦增加(9.69±2.57)cmH2O、(0.69±0.32)cm，與對(duì)照組比較各指標(biāo)均有顯著性意義(P＜0.01)。ADSCs移植治療后可以使注射局部尿道肌層得到明顯的加強(qiáng)和增厚，括約肌形態(tài)及功能得到明

9、顯的改善，周?chē)Y(jié)締組織緊密，支撐作用得到加強(qiáng)。橫紋肌肌肉分割分析顯示干細(xì)胞治療4周橫紋肌肌肉面積及其長(zhǎng)短軸比值均得到明顯增加。移植治療后尿道周?chē)哪z原蛋白含量明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：⑴通過(guò)消化分離，percoll密度梯度離心和preplate差速貼壁技術(shù)，可以獲得純度較高的SD大鼠ADSCs。本實(shí)驗(yàn)使用攜帶GFP基因重組的慢病毒成功高效地轉(zhuǎn)染了ADSCs，該方法為長(zhǎng)期觀測(cè)ADSCs的體內(nèi)狀況創(chuàng)造了條件。⑵本

10、研究提示：在特定誘導(dǎo)條件下ADSCs能被定向誘導(dǎo)分化為成肌細(xì)胞；并為SUI的干細(xì)胞移植治療提供了新的思路。⑶本部分研究通過(guò)雙側(cè)陰部神經(jīng)離斷的方法，成功建立了SUI的動(dòng)物模型，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。尿道橫紋括約肌呈封閉環(huán)形分布于雌性大鼠尿道的中外段，提示此處為控尿機(jī)制的主要部位。⑷ADSCs移植至壓力性尿失禁模型大鼠后能存活、分化而整合至宿主尿道括約肌，改善壓力性尿失禁大鼠的尿控功能，并且主要可能通過(guò)在體內(nèi)定向分化為肌細(xì)胞，增強(qiáng)尿道括約肌