rhBMP4促進(jìn)多潛能的人牙周韌帶干細(xì)胞成腱分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目標(biāo)：
　　干細(xì)胞為基礎(chǔ)的牙周再生是治療牙周疾病引起的組織破壞的一項(xiàng)新穎而有效的治療策略。牙周韌帶干細(xì)胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）是牙周再生理想的細(xì)胞來源。已知骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（Bone morphogenetic protein-4，BMP4）具有維持牙周干細(xì)胞干性和多向分化潛能的潛能。然而，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4在誘導(dǎo)牙周干細(xì)胞向肌腱／韌帶方向分化上的功能猶未可

2、知。
　　研究方法：
　　1.本研究采用酶消化法體外培養(yǎng)hPDLSCs。細(xì)胞的干性檢測：反轉(zhuǎn)錄PCR檢測干性指標(biāo)CD-146、c-Myc、Nanog和Oct-4A，流式細(xì)胞術(shù)鑒定牙周韌帶干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1和CD146的比例。細(xì)胞分化能力檢測：茜素紅染色鑒定成骨分化能力，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測分析細(xì)胞韌帶/肌腱標(biāo)記物SCX、Six1、Six2和TNC。
　　2.在體外培養(yǎng)的hPDLSCs中添加rhBMP4蛋白、BMP4過

3、表達(dá)質(zhì)?；騬hNoggin蛋白，接著Real-time PCR檢測過表達(dá)或抑制BMP4信號(hào)通路對hPDLSCs成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2以及肌腱發(fā)育的標(biāo)志基因Tenascin C（TNC）、Collagen1α1（COL1α1)和Collagen1α2(COL1α2)轉(zhuǎn)錄水平的變化，Western Blot檢測其Runx2和TNC的變化。
　　3.隨后通過對肌腱特異性轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis（SCX）mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及

4、細(xì)胞免疫熒光對表達(dá)位置的分析，結(jié)合搜索STRING數(shù)據(jù)庫中BMP4與SCX的關(guān)系，同時(shí)利用VISTA軟件分析SCX啟動(dòng)子上是否有Smad的結(jié)合位點(diǎn)。
　　研究結(jié)果：
　　1. hPDLSCs細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記基因、腱性標(biāo)記物以及具有骨向分化潛能：第三代hPDLSCs中CD146和STRO-1陽性表達(dá)百分比分別為65.26％和7.14%。內(nèi)源性干性基因RT-PCR顯示c-MYC和OCT-4A表達(dá)量與CD146接近，Nanog熒

5、光較低。hPDLSCs經(jīng)過三周成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)和茜素紅染色可見明顯的鈣化結(jié)節(jié)。內(nèi)源性成腱基因的RT-PCR顯示其較高表達(dá)SCX和Six2，而Six1和TNC表達(dá)較弱。
　　2. rhBMP4增加hPDLSCs中Runx2 mRNA和蛋白的表達(dá)：rhBMP4（10ng/ml,100ng/ml）對Runx2 mRNA表達(dá)的促進(jìn)呈時(shí)間依賴關(guān)系，處理后第一天開始出現(xiàn)，第三天變化明顯，而第七天未見明顯差異。rhNoggin(BMP4的拮抗劑)

6、（1拮抗劑gg）處理后的第一天對Runx2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，在第三天降低了表達(dá)水平。更進(jìn)一步地，蛋白質(zhì)定量分析實(shí)驗(yàn)同樣證明了rhBMP4（10ng/ml）處理1天后促進(jìn)hPDLSCs細(xì)胞核內(nèi)Runx2蛋白水平的表達(dá)。
　　3. BMP4促進(jìn)hPDSCs中TNC的表達(dá)并依賴于細(xì)胞外基質(zhì)濃度：rhBMP4(10 ng/ml,100 ng/ml）處理之后的第一天，TNC mRNA的表達(dá)水平明顯增加。同樣地，利用lipofectam

7、ine2000包裹BMP4過表達(dá)質(zhì)粒pNL-BMP4-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染hPDLSCs一天后，也在蛋白質(zhì)水平上增加TNC的表達(dá)。Westernblot的分析結(jié)果表明，高濃度的CollagenⅤ促進(jìn)hPDLSC中TNC蛋白的表達(dá)水平，BMP4在高濃度的CollagenⅤ（3mg/ml）環(huán)境下對TNC的表達(dá)水平有明顯促進(jìn)作用。BMP4在低濃度的CollagenⅤ（1.25mg/ml）環(huán)境下，對TNC蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有促進(jìn)作用。

8、　　4. BMP4維持hPDLSCs細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白基因的表達(dá)：反轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果顯示，在BMP4和Noggin處理后的第一天，ColIα1和ColIα2兩個(gè)基因的表達(dá)水平都沒有明顯變化。但是在處理之后第三天，對照組，高濃度BMP4組（100 ng/ml）和Noggin組（1 ng/ml），ColIα1和ColIα2的表達(dá)水平都降低，只有低濃度BMP4（10 ng/ml）組還維持著可見的ColIα1和ColIα2維持著基因表達(dá).

9、>　　5. BMP4增加hPDLSCs中SCX mRNA和蛋白的表達(dá)：BMP4蛋白對SCX的促進(jìn)成時(shí)間依賴關(guān)系，在處理之后第一天開始出現(xiàn)，處理之后第三天變化明顯，處理之后第七天變化不明顯。Noggin（1ug/ml）處理之后的第一天對SCX的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響，在處理之后的第三天降低SCX的表達(dá)水平。更進(jìn)一步地，蛋白質(zhì)的定量分析實(shí)驗(yàn)同樣證明了BMP4蛋白促進(jìn)hPDLSCs細(xì)胞核內(nèi)SCX蛋白的表達(dá)。
　　6. BMP4蛋白誘導(dǎo)SC

10、X的核向定位：低濃度BMP4（10 ng/ml）處理之后6小時(shí)的hPDLSC中，SCX在細(xì)胞核內(nèi)的定位顯著增加，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的定位減少。量化結(jié)果顯示，對照組中核內(nèi)SCX蛋白占總量的43%，BMP4使SCX的核內(nèi)定位提高到72%。
　　7. STRING數(shù)據(jù)庫和VISTA軟件分析表明SCX轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游存在有Smad和Smad3的結(jié)合位點(diǎn)。
　　研究結(jié)論：
　　rhBMP4能瞬時(shí)地誘導(dǎo)SCX的核內(nèi)定位，增加肌腱相關(guān)基因和/