人牙周韌帶細(xì)胞成骨分化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、牙周韌帶細(xì)胞(Periodontalligamentcells，PDLCs)是一個(gè)包含了處于不同分化方向和分化階段的異質(zhì)性細(xì)胞群，最近的研究提示PDLCs中存在成體干細(xì)胞，可以再生牙周組織，牙周韌帶干細(xì)胞成骨分化是其作為組織工程種子細(xì)胞的一個(gè)重要的功能表現(xiàn)。目前，對(duì)PDLCs的干細(xì)胞成分特征及其成骨分化的蛋白調(diào)控機(jī)制還不清楚。深入研究PDLCs的生物學(xué)特性，明確其干細(xì)胞成分特征，發(fā)現(xiàn)其潛在的分化標(biāo)記和分化機(jī)制，對(duì)充分利用牙周韌帶干細(xì)胞進(jìn)

2、行治療具有重要意義。本研究分離培養(yǎng)PDLCs，對(duì)其生物學(xué)特性和多向分化能力進(jìn)行分析，以明確牙周韌帶細(xì)胞中的干細(xì)胞成分特征，建立PDLCs誘導(dǎo)成骨分化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，探討PDLCs誘導(dǎo)成骨分化的分化標(biāo)記和蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制。 本研究包括以下三部分。 第一章人牙周韌帶細(xì)胞的生物學(xué)特性研究 目的：分離和培養(yǎng)人PDLCs，觀察其增殖能力、細(xì)胞周期、表型特征、多向分化等，以明確PDLCs的干細(xì)胞成分和分化潛能。

3、 方法：選取年輕患者因正畸拔除的前磨牙和第三恒磨牙，刮取牙根中1/3的牙周韌帶組織，采用I型膠原酶和Dispase聯(lián)合酶消化法分離培養(yǎng)獲得PDLCs，通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；細(xì)胞計(jì)數(shù)與MTT法描記細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期；免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)；礦化液、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)液分別誘導(dǎo)PDLCs向成牙骨質(zhì)/成骨樣細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，組織染色、免疫組織化學(xué)和RT-PCR檢測(cè)其多向分化能力

4、。 結(jié)果：培養(yǎng)的人PDLCs生長(zhǎng)旺盛，低密度接種形成細(xì)胞克隆。計(jì)數(shù)法和MTT法均顯示第2代細(xì)胞生長(zhǎng)曲線接近“S”形。體外連續(xù)培養(yǎng)10代的PDLCs具有較高比例的G0/G1期，平均為86.61％，增殖系數(shù)PI平均為13.08％，自第6代開始P1逐漸下降。免疫組化染色顯示細(xì)胞角蛋白陰性，波形絲蛋白染色陽性，間質(zhì)干細(xì)胞表面抗原STRO-1、CD-146染色陽性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)PDLCs的表面抗原顯示：三組不同來源的第二代PDLCs的S

5、TRO-1、CD-146、CD29、CD44、CD106和CD34的陽性表達(dá)平均值分別是14.4％、51.3％、99.9％、99.8％、76.8％和0.1％。連續(xù)培養(yǎng)后，STRO-1和CD-146的陽性表達(dá)百分比隨傳代逐漸下降。PDLCs誘導(dǎo)成骨分化21天后形成Vonkossa和茜素紅染色陽性結(jié)節(jié)。PDLCs誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化21天后，顯示有大量的胞外基質(zhì)糖胺多糖GAG合成，免疫組化檢測(cè)II型膠原陽性表達(dá)。PDLCs誘導(dǎo)向脂肪細(xì)胞分化2

6、1天后，油紅O染色見脂肪細(xì)胞和脂滴形成：RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞特有的轉(zhuǎn)錄子PPARγ2和LPLmRNA的表達(dá)顯著增加。 結(jié)論：本研究從細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、表型特征和多向分化潛能等方面證實(shí)PDLCs中存在成體干細(xì)胞，提示牙周韌帶來源的PDLCs可以作為牙周組織再生種子細(xì)胞的新來源，PDLCs誘導(dǎo)成骨分化實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究其成骨分化標(biāo)記和分化機(jī)制提供了可行的體外研究模型。 第二章牙本質(zhì)涎蛋白在人牙周韌帶細(xì)胞成骨分化過程中的表

7、達(dá) 目的：研究成牙本質(zhì)細(xì)胞相對(duì)特異性蛋白DSP和DSPPmRNA在人PDLCs向成牙骨質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化過程中的表達(dá)模式及可能的功能作用。 方法：誘導(dǎo)PDLCs成骨分化過程中，檢測(cè)ALP活性表達(dá)模式；免疫組化和Westernblot檢測(cè)DSP和OCN的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)DSPP和OCNmRNA的表達(dá)模式。 結(jié)果：PDLCs誘導(dǎo)培養(yǎng)前，OCN免疫染色陽性，誘導(dǎo)培養(yǎng)14天，OCN和DSP染色陽性。Westernb

8、lot顯示：PDLCs誘導(dǎo)前表達(dá)OCN，隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)OCN增加。PDLCs誘導(dǎo)前不表達(dá)DSP，誘導(dǎo)14天后，發(fā)現(xiàn)陽性條帶，隨PDLCs誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，陽性條帶密度增強(qiáng)。隨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，ALP活性上調(diào)，誘導(dǎo)14天和21天組ALP活性均較對(duì)照組有顯著性差異，p<0.05。RT-PCR結(jié)果顯示：未誘導(dǎo)培養(yǎng)的人PDLCs表達(dá)相對(duì)較低的OCN和DSPPmRNA，隨成骨誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，OCN和DSPPmRNA表達(dá)上調(diào)，各誘導(dǎo)組與對(duì)照組之間均有顯

9、著性差異，p<0.05。 結(jié)論：本研究進(jìn)一步證實(shí)PDLCs在體外能夠分化形成成牙骨質(zhì)/成骨樣細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)人PDLCs成骨分化過程中，表達(dá)DSP蛋白和DSPPmRNA，與ALP活性和OCN及其mRNA表達(dá)模式一致，提示DSP/DSPP參與調(diào)節(jié)PDLCs向成牙骨質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化，DSP/DSPP有可能與ALP和OCN一起作為PDLCs向成牙骨質(zhì)/成骨樣細(xì)胞分化的標(biāo)記。 第三章人牙周韌帶細(xì)胞成骨分化的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

10、 目的：比較人PDLCs成骨分化過程中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，建立PDLCs誘導(dǎo)成骨分化的差異表達(dá)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，探討PDLCs誘導(dǎo)成骨分化的分化標(biāo)記和蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制。 方法：通過膠內(nèi)差異雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜鑒定、數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)置與檢索系統(tǒng)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究PDLCs誘導(dǎo)成骨分化7天的差異表達(dá)蛋白質(zhì)；Westernblot驗(yàn)證部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)。 結(jié)果：獲得PDLCs誘導(dǎo)成骨分化7天的差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，共確認(rèn)差異大于1.5

11、倍的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)61個(gè)，質(zhì)譜鑒定確認(rèn)29個(gè)蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白質(zhì)的功能將其分為：細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)蛋白，核蛋白和其它蛋白。其中細(xì)胞骨架蛋白及細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)蛋白包括Vimentin、CaD、betatropomyosin、skeletalmuscletropomyosin、CHC、AnnexinA4和相關(guān)激酶PAK65參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架改建和信號(hào)傳導(dǎo)，影響細(xì)胞形態(tài)、增殖和遷移，提示這些蛋白在PDLCs成骨分化過程中發(fā)揮潛在的功能作用

12、且調(diào)節(jié)作用相似。核蛋白hnRNPC、NPM1和1aminA/C可能調(diào)節(jié)PDLCs的細(xì)胞周期和向成骨細(xì)胞分化。其它蛋白包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、1-ERBB2、彈性微纖維交界子3、真核蛋白(SGT1Bprotein)、真核轉(zhuǎn)化延長(zhǎng)因子1δ同形體1、儲(chǔ)鐵蛋白、網(wǎng)織體先驅(qū)、免疫調(diào)節(jié)劑Clq-C、H鏈和A鏈等蛋白以及一些未命名蛋白。CaD和hnRNPC的差異表達(dá)經(jīng)Westernblot進(jìn)一步得到驗(yàn)證。 結(jié)論：本研究建立了PDLCs成骨分化的差異