豬肌肉組織差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、豬肉是肉類(lèi)消費(fèi)的重要組成部分,是人類(lèi)獲得蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要途徑之一,在國(guó)人飲食結(jié)構(gòu)中占據(jù)絕對(duì)的比重；而豬不僅可作為肉產(chǎn)品的重要來(lái)源,還可作為模式器官動(dòng)物。因此,深入探討豬骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)制不僅對(duì)畜牧生產(chǎn)有重要意義,同時(shí)也為人類(lèi)醫(yī)學(xué)研究提供重要補(bǔ)充。本研究通過(guò)建立的以雙向電泳和質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析平臺(tái),開(kāi)展豬肌肉組織蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究,系統(tǒng)分析了國(guó)內(nèi)外典型品種(梅山豬與大白豬)及梅山豬不同發(fā)育時(shí)期骨骼肌的蛋白質(zhì)組學(xué)差異,并就部分

2、差異蛋白在基因水平做了進(jìn)一步的研究,以期為闡明豬肌肉品質(zhì)形成的分子機(jī)制奠定了分子基礎(chǔ)。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1.從不同的樣品處理、不同上樣量、不同pH IPG膠條的選擇、不同二向膠濃度、不同染色方法等方面對(duì)豬肌肉組織蛋白雙向電泳分離條件進(jìn)行優(yōu)化,并就一些常見(jiàn)問(wèn)題進(jìn)行了詳細(xì)分析,從而建立了豬肌肉組織蛋白雙向電泳分離技術(shù)。結(jié)果顯示,對(duì)于豬肌肉組織樣品,采用液氮研磨+超聲破碎的策略比單純液氮研磨更合適,蛋白質(zhì)溶解性更好,核酸

3、污染少,圖譜比較均勻清晰；18鋤pH4-7的膠條比pH3-10NL分離效果好；對(duì)于銀染18 cm pH4-7的膠條150μg上樣量比較適宜。與前人相比,采用本方法獲得圖譜的分辨率及重復(fù)性都有所提高。
　　 2.采用基于雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)純種大白豬和梅山豬背最長(zhǎng)肌進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。共發(fā)現(xiàn)25個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn),梅山豬中高表達(dá)的10個(gè),而大白豬中高表達(dá)的15個(gè),其中20個(gè)蛋白點(diǎn)經(jīng)MALDI-TOF-MS方法成

4、功鑒定,得到14個(gè)不同的蛋白,這些蛋白按功能可以分為4類(lèi):代謝相關(guān)蛋白,防御與應(yīng)激相關(guān)蛋白,肌纖維結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白,其他未歸類(lèi)蛋白。此外,我們采用熒光定量PCR方法對(duì)其中7個(gè)差異表達(dá)蛋白做了mRNA水平上的表達(dá)分析,結(jié)果表明蛋白質(zhì)水平和mRNA水平存在較理想的相關(guān)性。同時(shí)我們還分析了大白豬和梅山豬背最長(zhǎng)肌肌球蛋白重鏈4種亞型(Ⅰ、ⅡA、ⅠB和ⅡX)在mRNA水平上的表達(dá)情況,結(jié)果顯示Ⅰ型纖維在兩品種間沒(méi)顯著差異(P>0.05),ⅡA和ⅡX在

5、梅山豬中顯著高表達(dá)(P<0.05),而ⅡB在大白豬中顯著高表達(dá)(P<0.05)。
　　 3.利用18cm pH4-7的膠條,第二向12.5％的SDS-PAGE對(duì)梅山豬背最長(zhǎng)肌總蛋白進(jìn)行2-DE分離,共得到36塊2-DE膠(4*3*3),采用軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析,經(jīng)one-way ANOVA分析(P<0.01),共發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期間差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(>1.5倍)共99個(gè),其中胚胎65天與出生后3天相比,有78個(gè)(下調(diào)27個(gè),上調(diào)51個(gè))；

6、出生后3天與60天相比,有70個(gè)(下調(diào)21個(gè),上調(diào)49個(gè))；出生后60天與120天相比,有40個(gè)(下調(diào)22個(gè),上調(diào)18個(gè))。經(jīng)MALDI-TOF/MS質(zhì)譜成功鑒定90個(gè)蛋白點(diǎn),得到66個(gè)不同的蛋白,按功能分為8類(lèi):代謝相關(guān)蛋白為最大一類(lèi),占25％,包括糖酵解代謝相關(guān)酶、線粒體氧化代謝相關(guān)酶及其他代謝相關(guān)酶類(lèi),糖酵解代謝相關(guān)酶隨著肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育呈上調(diào)表達(dá)趨勢(shì),而線粒體氧化代謝相關(guān)酶呈相反趨勢(shì)；第二大類(lèi)為肌纖維調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白,占19％,包括M

7、LC1sa、MLC1sb、MyBP-H、ACTN3、CapZ-β等；細(xì)胞骨架蛋白占11％,包括desmin、cofilin-1、FSCN1、gelsolin等7個(gè),這些蛋白隨著肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育均呈下調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；細(xì)胞防御相關(guān)蛋白占14％,包括HSP27、Hsp60、Hsp90、DJ1、TCP1等；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白占6％；抗氧化與解毒相關(guān)蛋白8％；運(yùn)輸?shù)鞍?％；其他未歸類(lèi)蛋白占11％。這些蛋白按細(xì)胞組成可分為6類(lèi),有43％的屬于胞漿蛋白,26

8、％的屬于細(xì)胞骨架蛋白,6％的屬于膜蛋白,11％的為線粒體蛋白,核蛋白占9％。用蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)與梅山豬背最長(zhǎng)肌不同發(fā)育時(shí)期轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜數(shù)據(jù)比較分析大部分基因在轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平存在較好的一致性,只是在翻譯水平由于存在翻譯后修飾,蛋白水平的更為復(fù)雜。此外,我們通過(guò)設(shè)計(jì)特意引物對(duì)梅山豬背最長(zhǎng)肌不同發(fā)育時(shí)期的肌動(dòng)蛋白重鏈的四種亞型進(jìn)行熒光定量分析,發(fā)現(xiàn)在胚胎65天ⅡX和ⅡB型纖維已開(kāi)始表達(dá),但占比例很少,主要為Ⅰ型纖維(81.5％),而就整個(gè)發(fā)育

9、過(guò)程Ⅰ型纖維由胚胎65天的81.5％遞減到出生后120天的15.5％,Ⅱb型纖維卻由2.8％遞增到48.7％,四種肌纖維在豬肌肉發(fā)育過(guò)程中處于Ⅰ←→ⅠA←→ⅡX←→ⅡB相互轉(zhuǎn)換的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。另外,我們采用Western Blot方法,選取AFP、vimentin、desmin和HSP90等4個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證分析,發(fā)現(xiàn)結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)較一致,進(jìn)一步說(shuō)明了我們2-DE和質(zhì)譜結(jié)果的可靠性。
　　 4.選取ATP5B、ATP5A、1

10、4-3-3ζ等三個(gè)差異表達(dá)蛋白對(duì)應(yīng)的基因,作了進(jìn)一步的分析。組織表達(dá)譜顯示:ATP5B和ATP5A在睪丸、子宮、脂肪等組織相對(duì)高表達(dá),心、睪丸、卵巢、小腸等組織次之,肌肉和肺中的表達(dá)相對(duì)較低,而在各組織中ATP5B的表達(dá)量均比ATP5A高；發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ基因轉(zhuǎn)錄本1在脂肪中表達(dá)量最高,心臟、小腸和肌肉次之,肝臟、大腦、睪丸、卵巢中等表達(dá),在腎臟和胃中表達(dá)量最低,轉(zhuǎn)錄本2相對(duì)于轉(zhuǎn)錄子1在各組織中表達(dá)豐度都很低,從兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在不同類(lèi)型肌

11、肉表達(dá)分布來(lái)看,14-3-3ζ基因的肌纖維特異性似乎不明顯。不同時(shí)期發(fā)育表達(dá)譜顯示:ATP5B和ATP5A在3天和胚胎期高表達(dá),生長(zhǎng)后期表達(dá)量較低,而梅山中在大多數(shù)時(shí)期都比大白高；14-3-3ζ基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄子在胚胎65天特異的高表達(dá),這與差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的該基因蛋白水平表達(dá)是一致的,而不同時(shí)期品種間相比,兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在大白中的表達(dá)均高于梅山。多態(tài)性分析:ATP5B基因第八外顯子75處有-A/G突變,利用梅山豬和大白豬雜交組建的F2代