hBMP-2基因修飾脂肪源性基質(zhì)干細(xì)胞的成骨研究.pdf

1、【目的】 1．目前，國內(nèi)骨科領(lǐng)域?qū)θ酥驹葱曰|(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)研究較少，缺乏對人ADSCs生物學(xué)特性的系統(tǒng)研究，本實驗將首先證實提取的hADSCs具有多向分化潛能，建立細(xì)胞的體外培養(yǎng)和成骨、成脂誘導(dǎo)體系。觀察hADSCs的生長特性，表面抗原的表達(dá)，以及體外傳代培養(yǎng)和成骨誘導(dǎo)對表面抗原的影響。評價體外傳代培養(yǎng)對hADSCs增殖能力和凋亡的影響。 2．ADSCs含量豐富，作為基因載體細(xì)胞優(yōu)勢明顯，國外有報道證明hAD

2、SCs可有效表達(dá)外源基因，但缺乏外源基因?qū)?xì)胞生物學(xué)影響的研究，本實驗第二章的目的是將攜有BMP-2基因的腺病毒轉(zhuǎn)染hADSCs，檢測BMP2蛋白的表達(dá)；觀察BMP一2基因修飾對hADSCs周期、凋亡及成骨分化的影響；觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成骨能力。 3．目前國內(nèi)外對動物ADSCs的研究多集中在鼠、兔等中小型動物，而對大動物的研究更具有臨床指導(dǎo)意義。第三章中我們將建立犬ADSCs體外培養(yǎng)體系，確定其成骨、成脂分化潛能，觀察細(xì)胞

3、一般生物學(xué)特性；將攜有BMP-2基因的腺病毒轉(zhuǎn)染犬ADSCs，觀察BMP2蛋白的表達(dá)及裸鼠體內(nèi)成骨情況；將細(xì)胞與TCP材料復(fù)合，觀察細(xì)胞在材料上的生長狀況及裸鼠體內(nèi)成骨情況。 4．目前尚未見到應(yīng)用ADSCs進(jìn)行大動物自體骨缺損修復(fù)研究的報道，在第四章中我們將建立犬尺骨節(jié)段性骨缺損，評估成骨誘導(dǎo)及BMP-2基因修飾的犬ADSCs修復(fù)自體尺骨骨缺損的能力，為將來的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。 [方法] 1．從人脂肪組織中提取A

4、DSCs，描記生長曲線，通過流式細(xì)胞技術(shù)觀察細(xì)胞表面抗原CD34、CD44、CD68、CD71、CD90、CDl05表達(dá)及變化，觀察長期體外培養(yǎng)對細(xì)胞凋亡的影響。通過ALP、von Kossa染色及Rr-PCR檢測hADSCs成骨分化潛能；通過油紅O染色檢測ADSCs成脂分化潛能。 2．將BMP-2基因轉(zhuǎn)染hADSCs，免疫沉淀+Westernblot法和ELISA法檢測BMP-2表達(dá)，確定BMP-2表達(dá)量及表達(dá)穩(wěn)定性；通過流

5、式細(xì)胞技術(shù)觀察BMP-2基因轉(zhuǎn)染對細(xì)胞周期和凋亡的影響；堿性磷酸酶(ALP)染色、ALP定量測定、鈣結(jié)節(jié)染色及RT-PCR分析BMP-2基因轉(zhuǎn)染對hADSCs分化的調(diào)控，并將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注入裸鼠股部肌內(nèi)，通過X線及組織學(xué)染色觀察體內(nèi)成骨情況。 3．從犬脂肪組織中提取ADSCs，描記生長曲線，通過ALP染色及定量分析、von Kossa染色、免疫組化檢測犬ADSCs成骨分化潛能，通過油紅O染色檢測犬ADSCs成脂分化潛能；轉(zhuǎn)染BMP

6、-2基因，ELISA法檢測BMP-2表達(dá)，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注入裸鼠股部肌內(nèi)，通過X線及組織學(xué)染色觀察體內(nèi)成骨情況；掃描電鏡觀察細(xì)胞與17CP材料復(fù)合情況，組織學(xué)染色觀察細(xì)胞材料復(fù)合物在裸鼠皮下成骨情況。 4．制作犬尺骨節(jié)段骨缺損模型，分別植入四組材料，組l：單純TCP材料組；組2：ADSCs+TCP復(fù)合組；組3：成骨誘導(dǎo)ADSCs+TCP復(fù)合組；組4：adv-hBMP2-ADSCs+TCP復(fù)合組。通過大體觀察、影像學(xué)及組織學(xué)觀察、

7、形態(tài)學(xué)計量、礦化沉積分析比較各組修復(fù)骨缺損情況。 【結(jié)果】 1．原代細(xì)胞表面高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD44、CD71、CD90 、CDl05，低表達(dá)血源性細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34、CD68。CD44、CD90、CDl05不隨傳代變化，CD71隨細(xì)胞密度不同表達(dá)不同。早期細(xì)胞凋亡率為1％～2％，傳代過程中凋亡率逐漸增加，但增幅不大。ALP染色、von Kossa染色和RT-PCR檢測證實細(xì)胞傳至第8代時仍能保持成骨分化

8、潛能。油紅O染色證實細(xì)胞具有成脂分化潛能。 2．轉(zhuǎn)基因后免疫沉淀+Westernblot法和ELISA法顯示轉(zhuǎn)染BMP-2的hADSC高表達(dá)BMP-2，轉(zhuǎn)染21天后表達(dá)量無明顯降低。流式細(xì)胞顯示腺病毒轉(zhuǎn)染抑制細(xì)胞的增殖，同時增加了細(xì)胞的凋亡。ALP染色、ALP定量測定、鈣結(jié)節(jié)染色及RT-PCR顯示轉(zhuǎn)基因ADSC向成骨細(xì)胞方向發(fā)生分化；裸鼠肌內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因細(xì)胞后2周即有異位骨形成，4周明顯增多，對照組無骨組織形成。 3．A

9、LP染色及定量分析、von Kossa染色、免疫組化證實犬ADSCs具有成骨分化潛能；油紅0染色證實ADSCs具有成脂分化潛能。ELISA顯示轉(zhuǎn)BMP-2基因的犬ADSCs可以高表達(dá)BMP-2，X線組織學(xué)染色證實2周后裸鼠體內(nèi)異位骨形成。掃描電鏡顯示細(xì)胞與TCP材料復(fù)合良好，組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)BMP-2基因修飾的細(xì)胞材料復(fù)合物在裸鼠皮下肌肉側(cè)有成骨，而皮下側(cè)未見成骨。 4．大體觀察、放射學(xué)及組織學(xué)觀察、形態(tài)學(xué)計量、礦化沉積率分析顯

10、示advhBMP2-ADSCs+TCP復(fù)合組較其他各組明顯促進(jìn)骨缺損修復(fù)，成骨誘導(dǎo)ADSCs+TCP復(fù)合組盡管也促進(jìn)新骨形成，但效果有限。 【結(jié)論】 1.人脂肪組織中存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞，且含量豐富，生物學(xué)性能穩(wěn)定；貼壁法可以得到相對較純的基質(zhì)細(xì)胞;誘導(dǎo)并未引起所選表面抗原的改變，而細(xì)胞密度增加明顯提高了CD71的表達(dá);成骨誘導(dǎo)分化途徑可能有別于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，此方面尚需進(jìn)一步研究。 2. hADSCs可

11、以在體外持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)目的蛋白;腺病毒轉(zhuǎn)染影響了hADSCs的細(xì)胞周期和凋亡;轉(zhuǎn)染BMP2基因后，hADSCs自身有向成骨細(xì)胞分化的趨勢，但未能進(jìn)入成熟期;Adv-BMP2-ADSCs在裸鼠體內(nèi)有明顯的成骨作用，但細(xì)胞自身可能沒有或較少參加成骨過程。 3.犬脂肪組織中同樣存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞，且細(xì)胞接受外源性基因后，可以有效高表達(dá)目的蛋白。 4.利用BMP-2基因修飾犬ADSCs可以明顯促進(jìn)體內(nèi)新生骨形成，有效