基于肝損傷小鼠模型重構(gòu)小鼠和人的肝臟.pdf

1、目前，肝病相關(guān)的體內(nèi)研究多基于在小鼠的肝臟開(kāi)展。然而，小鼠肝臟與人的存在差異，致使基于小鼠肝臟獲得的許多研究結(jié)果不能直接應(yīng)用到人體，而人的體內(nèi)研究受倫理和技術(shù)等方面的制約。肝臟人源化的嵌合體（人鼠嵌合肝）小鼠是在人肝臟發(fā)育和再生機(jī)制、人類肝臟相關(guān)疾病（肝炎、肝硬化和肝癌等）發(fā)病機(jī)制、肝炎病毒(HBV和HCV等)易感動(dòng)物模型建立、藥物代謝動(dòng)力學(xué)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，其也為在大動(dòng)物（如小型豬）體內(nèi)重構(gòu)人肝臟提供理論依據(jù)和進(jìn)行實(shí)踐探索，并

2、成為臨床前研究由鼠到人之間的重要載體和橋梁。因此，制備高比率嵌合有人肝細(xì)胞的人-鼠嵌合肝對(duì)人類的肝病研究具有巨大而深遠(yuǎn)的意義。
　　 早期是將人肝細(xì)胞異位移植進(jìn)小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝，現(xiàn)在隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們開(kāi)始將目光轉(zhuǎn)向利用干細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)人和鼠肝臟的嵌合。干細(xì)胞(stem cells，SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，它是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛

3、在功能，醫(yī)學(xué)界稱為“萬(wàn)用細(xì)胞”。這就為干細(xì)胞在一定環(huán)境下發(fā)育成肝細(xì)胞提供了理論依據(jù)。同時(shí)也為在小鼠體內(nèi)建立人鼠嵌合肝模型提供了可能。
　　 截止到現(xiàn)在，國(guó)內(nèi)外均有文獻(xiàn)報(bào)道將干細(xì)胞通過(guò)核移植或?qū)m內(nèi)移植進(jìn)正常動(dòng)物體內(nèi)，以實(shí)現(xiàn)多組織多器官的嵌合。但是，由于宿主體內(nèi)的微環(huán)境中缺乏移植細(xì)胞生長(zhǎng)的各種激素和生長(zhǎng)因子，宿主細(xì)胞的增殖將優(yōu)先于移植細(xì)胞，因此，各組織器官的嵌合率比較低。為了克服上述困難，得到高比率嵌合的個(gè)體，選用特定器官缺陷的動(dòng)物

4、模型作為受體環(huán)境是較為理想的選擇。
　　 富馬酰乙酰乙酸鹽水解酶(Fah)基因敲除小鼠缺乏Fah基因，酪氨酸分解代謝的最后一步受到阻礙，導(dǎo)致富馬酰乙酰乙酸鹽(FAA)和前體(MAA)底物的聚集，F(xiàn)AA與MAA對(duì)肝臟有毒性。利用此肝損傷小鼠模型作為受體動(dòng)物，將人干細(xì)胞移植進(jìn)該鼠的囊胚中，有望提高人干細(xì)胞在宿主體內(nèi)的增殖優(yōu)勢(shì)，這對(duì)研發(fā)人肝細(xì)胞高比率嵌合的嵌合肝模型是至關(guān)重要的。
　　 為實(shí)現(xiàn)靈敏的非損傷、實(shí)時(shí)和可視化體內(nèi)示蹤

5、移植供體細(xì)胞及其在體內(nèi)衍生的細(xì)胞，通過(guò)綜合分析活體內(nèi)生物發(fā)光[用熒光素酶(Luciferase，Luc)基因標(biāo)記細(xì)胞等]成像和熒光[熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP和RFP等）]成像各自的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，為將生物發(fā)光成像和熒光成像的優(yōu)點(diǎn)集為一身，我們將用雙報(bào)告或三熒光報(bào)告基因標(biāo)記供體移植細(xì)胞，已達(dá)到活體示蹤的目的。
　　 在研究中，我們首先利用小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(Mouse inducedpluripotent stem cells，miP

6、SCs)通過(guò)囊胚腔移植(Blastocyst transplantation)建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型，待方法和技術(shù)成熟后再利用人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Humanbone marrow mesenchymal stem cells，hMSCs)通過(guò)囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動(dòng)物模型。
　　 第一部分小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型
　　 目的:
　　 通過(guò)小鼠誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)

7、胞(miPSCs)囊胚腔移植建立鼠/鼠嵌合肝動(dòng)物模型，一方面可以觀察干細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)受損肝臟的修復(fù)作用，另一方面為建立人/鼠嵌合肝模型提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 (1)慢病毒載體pEF1 a-ZsGreen-Fluc鑒定，慢病毒生產(chǎn)與鑒定，慢病毒感染miPSCs;(2)檢測(cè)病毒感染后的miPSCs(LG-miPSCs)是否仍然保持其干性;(3)鼠/鼠嵌合體動(dòng)物的制作將攜帶有綠色熒光蛋白(ZsGreen)

8、和熒光素酶(Fluc)雙報(bào)告基因的miPSCs移植進(jìn)Fah(-/-)小鼠的囊胚中，然后將囊胚移植進(jìn)假孕母鼠的子宮內(nèi)，待其出生;(4)體式熒光顯微鏡檢測(cè)待小鼠出生后3天在鏡下觀察是否可以看到綠色熒光，待小鼠成年后取材，取其肝臟、腎臟、心臟、腦、肺臟、脾臟等臟器在鏡下觀察是否可見(jiàn)綠色熒光;(5)小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)小鼠從出生到成年，不同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射Fluc底物，觀察是否可見(jiàn)Fluc熒光;(6)PCR檢測(cè)取成年后小鼠的肝臟、鼠尾、肺、腦、腎

9、臟、心臟、脾臟、腸等組織，一部分用于提取基因組DNA[另一部分用于制備石蠟切片以用于HE染色和免疫熒光(Immunofluorescence)檢測(cè)]，并采用Fah引物PCR檢測(cè)各器官中是否有移植細(xì)胞的嵌合;(7) HE染色觀察嵌合體動(dòng)物肝臟的組織結(jié)構(gòu)以確定肝臟結(jié)構(gòu)是否正常;(8)免疫熒光檢測(cè)檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟中Fah基因的表達(dá)水平，及其白蛋白(Alb)、CK18、CK19、轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)的表達(dá);(9) Western

10、blot檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟中Fah基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)慢病毒載體鑒定、感染miPSCs以及其干性的鑒定鑒定結(jié)果符合預(yù)期，感染miPSCs(LG-miPSCs)效率接近100％，LG-miPSCs仍保持其多向分化潛能;
　　 (2)妊娠結(jié)局先后將LG-miPSCs移植進(jìn)160枚Fah(-/-)小鼠的囊胚中，接著種植到10只假孕母鼠的子宮內(nèi)，有四窩仔鼠順利出生，數(shù)量共38只，經(jīng)過(guò)撤藥處理后，最終有2

11、只幸存鼠發(fā)育到成年;
　　 (3)體視熒光顯微鏡和小動(dòng)物活體成像儀檢測(cè)從出生到取材各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到ZsGreen和Fluc雙報(bào)告基因的表達(dá);
　　 (4) Fah或Lue基因的基因型鑒定采用PCR對(duì)潛在的嵌合鼠所取肝臟組織針對(duì)FAH或Luc基因行基因型鑒定，在嵌合肝中檢測(cè)到野生型Fah基因和報(bào)告基因Fluc的存在;
　　 (5)HE染色嵌合鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)與正常小鼠的結(jié)構(gòu)基本一致，而撤藥的和沒(méi)撤藥的Fah(-/

12、-)小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)紊亂無(wú)序;
　　 (6)免疫熒光檢測(cè)嵌合體小鼠肝臟免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，大部分肝細(xì)胞表達(dá)Fah，兩只嵌合體小鼠的嵌合肝中LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞的嵌合率分別為84.69％和88.43％，同時(shí)Fah陽(yáng)性的肝細(xì)胞（即LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞）能夠正常表達(dá)Alb、CK18、CK19和teansferrin;
　　 (7)Western blot檢測(cè)Fah基因表達(dá)兩只嵌合體小鼠的嵌合肝均能正常

13、表達(dá)Fah基因，而Fah(-/-)小鼠未檢測(cè)到Fah基因表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)成功獲得LG-miPSCs衍生的鼠肝細(xì)胞高比率嵌合的鼠-鼠嵌合肝小鼠模型，這為進(jìn)一步利用hMSCs通過(guò)囊胚腔移植建立人/小鼠嵌合肝動(dòng)物模型奠定了良好基礎(chǔ)。
　　 第二部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)囊胚腔移植建立人/鼠嵌合肝動(dòng)物模型的前期工作
　　 目的:
　　 通過(guò)人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(hMSCs)囊胚腔移

14、植在小鼠受損肝臟上建立人/鼠嵌合肝動(dòng)物模型，該模型一方面將為在生物活體內(nèi)研究人干細(xì)胞生物學(xué)行為提供理想模型，另一方面也將為在體內(nèi)研究人類肝臟發(fā)育和再生、肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展和治療以及藥物代謝評(píng)價(jià)提供理想模型。
　　 材料和方法:
　　 (1)慢病毒載體pCMV-RFP-Alb-fLuc-ZsGreen(簡(jiǎn)稱為pCRAGL)鑒定，慢病毒生產(chǎn)與鑒定，慢病毒感染hMSCs;
　　 (2)病毒感染后hMSCs干性的鑒定;<