固有免疫細(xì)胞在肝臟損傷和再生中的效應(yīng)機(jī)制.pdf

1、肝臟是機(jī)體最大的消化器官，承擔(dān)著分泌膽汁、合成涉及生命活動中重要蛋白質(zhì)和解毒功能。與其它器官不同，肝臟具有肝動脈和門靜脈兩套血液供應(yīng)途徑，鑒于這種特殊的解剖學(xué)位置和功能，肝臟一直暴露于大量的腸道來源的抗原物質(zhì)，包括病原菌、毒素、腫瘤細(xì)胞和細(xì)菌代謝產(chǎn)物以及無害的食物抗原，這樣就決定了肝臟不僅承擔(dān)著“內(nèi)部血液過濾”的作用，同時(shí)還“肩負(fù)”清除腸道來源的外來物質(zhì)的重任。所以人們推測肝臟必須擁有一套快速選擇性的反應(yīng)機(jī)制去應(yīng)對這些肝臟特異性潛在“危

2、險(xiǎn)信號”。固有免疫反應(yīng)作為入侵病原菌的一線防御機(jī)制，以及局部免疫反應(yīng)機(jī)制在應(yīng)對各種各樣的免疫挑戰(zhàn)中的作用備受青睞。已知肝臟是細(xì)胞因子、補(bǔ)體和急性期反應(yīng)蛋白這類可溶性分子的合成部位，而且還有大量的吞噬細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞。根據(jù)肝臟高比例的固有免疫細(xì)胞(主要指Kupffer細(xì)胞、NKT細(xì)胞和NK細(xì)胞)和它們對肝臟外源刺激的快速反應(yīng)能力，肝臟被定義為具有固有免疫特性的器官已經(jīng)被多家研究結(jié)果所支持，因此，通過結(jié)合“肝臟學(xué)”和“免疫學(xué)”

3、，一門新型學(xué)科“肝臟免疫學(xué)”應(yīng)運(yùn)而生。大量資料研究顯示肝臟積聚的這些固有免疫細(xì)胞在肝臟的免疫監(jiān)視功能中發(fā)揮重要作用，譬如抗病毒、抗寄生蟲和抗細(xì)菌感染。然而過度的免疫細(xì)胞活化有時(shí)可能對肝細(xì)胞進(jìn)行意想不到的自身攻擊，引起自身免疫性的肝臟損傷。本研究旨在探索固有免疫反應(yīng)在肝臟免疫損傷和肝臟再生中的作用，主要試圖回答以下三個(gè)科學(xué)問題：建立新型NK細(xì)胞介導(dǎo)的小鼠肝炎模型，推動NK細(xì)胞在自身免疫性肝病中作用機(jī)制的深入研究；深入了解NK細(xì)胞在ConA

4、誘導(dǎo)的肝臟損傷的作用；肝臟固有免疫細(xì)胞對肝臟再生的調(diào)節(jié)機(jī)制，特別是探討HBV感染是如何通過固有免疫反應(yīng)途徑來負(fù)調(diào)節(jié)小鼠肝臟再生。本研究獲得的主要結(jié)果大致分為以下四個(gè)部分： 新型NK細(xì)胞介導(dǎo)、TLR3激動劑誘導(dǎo)的肝炎模型的建立：目前，T細(xì)胞、NKT細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在自身免疫性肝炎中的作用研究甚多，相應(yīng)的動物模型均有報(bào)道。然而，NK細(xì)胞在肝臟損傷中的作用似乎顯得很神秘。本部分研究目的就是建立一種NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎小鼠動物模型，來促進(jìn)N

5、K細(xì)胞在自身免疫性肝炎的機(jī)制研究。我們采用了TLR3配體聚肌胞(poly(I:C))活化NK細(xì)胞，觀察后續(xù)的肝臟損傷。B6小鼠腹腔注射poly(I:C)20微克/克體重，通過流式細(xì)胞術(shù)分析肝臟NK細(xì)胞比例和絕對數(shù)，血清轉(zhuǎn)氨酶和H&E染色被用作評價(jià)肝臟損傷的指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)poly(I:C)注射后，肝臟NK細(xì)胞顯著聚集和活化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)血清ALT和AST水平輕微升高，發(fā)現(xiàn)肝臟內(nèi)輕度炎癥反應(yīng)和局灶性壞死；如果清除了NK細(xì)胞可以顯著減輕poly(I:

6、C)誘導(dǎo)的肝臟損傷；中和內(nèi)源性的Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素12可以抵消肝臟NK細(xì)胞的聚集和后續(xù)的肝損傷；如果封閉血管細(xì)胞粘附分子-1也可以減輕poly(I:C)誘導(dǎo)的肝臟損傷。這些數(shù)據(jù)表明poly(I:C)偏向性地招募和活化了肝臟NK細(xì)胞，后者是該模型的主要效應(yīng)細(xì)胞。從所誘導(dǎo)的肝炎模型的性質(zhì)來看，由于本研究所采用的poly(I:C)是病毒模擬物，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的反應(yīng)類似于病毒感染反應(yīng)，結(jié)合所誘導(dǎo)的肝臟組織病理損傷特點(diǎn)，poly(

7、I:C)誘導(dǎo)肝臟損傷類似人類病毒性肝炎；由于poly(I:C)誘導(dǎo)的肝臟損傷是由于自身過度活化的NK細(xì)胞破壞了肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞，所以這種損傷又具有自身免疫性肝炎的特點(diǎn)。 在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型中高水平IFN-γ抑制了NK細(xì)胞毒活性：ConA誘導(dǎo)的肝臟損傷是常用的研究肝臟免疫損傷的動物模型，NKT細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在該模型中起著不可缺少的作用，然而NK細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型中的作用不甚清楚。本研究目的是了解在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型

8、中高水平的IFN-γ對NK細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用。ConA注射小鼠的淋巴細(xì)胞或者NK細(xì)胞系(NK92和NKL)的細(xì)胞毒活性通過51Cr釋放試驗(yàn)測定；AsGM1清除NK細(xì)胞后來評價(jià)NK細(xì)胞在ConA誘導(dǎo)的肝炎中的作用。NK細(xì)胞受體和細(xì)胞毒分子的表達(dá)用RT-PCR測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ConA注射12小時(shí)后B6小鼠血清IFN-γ顯著增加，而SCID小鼠增加不明顯；NK細(xì)胞對YAC-1的殺傷能力也有輕度下降；如果NK細(xì)胞用ConA注射小鼠的血清刺激8小時(shí)，N

9、K細(xì)胞的細(xì)胞毒活性下降，這種作用可以被抗IFN-γ阻斷；高濃度的IFN-γ(＞1000U/mL)可以抑制上述兩種細(xì)胞系的體外細(xì)胞毒活性，同時(shí)伴有下調(diào)的NKG2D和上調(diào)的NKG2A，這種抑制沒有發(fā)生在NKG2D配體陰性細(xì)胞系。結(jié)果提示在ConA誘導(dǎo)的肝炎模型中，NK細(xì)胞毒活性可以顯著地被高水平的IFN-γ抑制，這可能是NK細(xì)胞在該模型中不起作用的原因。 選擇性地去除肝臟NKT細(xì)胞促進(jìn)了肝臟再生：雖然ConA作為一種T細(xì)胞刺激劑可以

10、引起NKT細(xì)胞介導(dǎo)的肝臟損傷，同時(shí)非毒性劑量的ConA可以激活包括NKT細(xì)胞在內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，從而阻止腫瘤在肝臟內(nèi)的轉(zhuǎn)移，但是ConA致敏的NKT細(xì)胞在肝臟修復(fù)中的作用不甚清楚。本研究目的是了解用非毒性劑量的ConA預(yù)先刺激NKT細(xì)胞，來觀察其對肝臟再生的影響。肝臟切除手術(shù)被用作肝臟再生模型，手術(shù)前24小時(shí)注射非肝臟毒性劑量的ConA；肝重/體重比，PCNA標(biāo)記和BrdU摻入作為肝臟再生的衡量參數(shù)；肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)目及活化狀態(tài)采用流式細(xì)

11、胞儀檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肝臟切除后，肝重/體重比、PCNA標(biāo)記和BrdU摻入在ConA預(yù)處理小鼠明顯高于PBS處理小鼠，說明ConA刺激可以促進(jìn)肝臟再生；流式細(xì)胞儀分析顯示ConA注射8小時(shí)后，NKT細(xì)胞明顯活化并且選擇性地消失；而且，NKT細(xì)胞表達(dá)過多的凋亡相關(guān)的分子，如Fas和AnnexinV。所以，ConA促進(jìn)肝臟再生主要是通過消除肝臟的NKT細(xì)胞，而后者是通過活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。 NKT細(xì)胞活化導(dǎo)致HBV小鼠肝臟再生下降：上

12、述的資料說明了NKT細(xì)胞在正常情況下對肝臟再生的負(fù)性調(diào)節(jié)效應(yīng)，從長遠(yuǎn)研究目的來說，我們就是想了解在像病毒感染等異常情況下，肝臟固有免疫細(xì)胞對肝臟再生的調(diào)節(jié)機(jī)制。HBV感染經(jīng)常導(dǎo)致爆發(fā)性肝炎，被認(rèn)為與肝臟再生能力下降有關(guān)。但是，HBV感染所致的肝臟再生下降的機(jī)制不甚清楚。本研究主要是探討HBV感染對肝臟再生的影響，特別是集中了解NKT細(xì)胞在肝臟再生下降中的作用，來了解固有免疫反應(yīng)在肝臟修復(fù)過程中的調(diào)節(jié)作用。2/3小鼠肝臟切除作為肝臟再生模

13、型，所采用鼠種為HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，和同背景野生型小鼠作為對照；肝重/體重比，PCNA標(biāo)記和BrdU摻入作為肝臟再生的衡量參數(shù)；肝臟淋巴細(xì)胞數(shù)目及活化狀態(tài)采用流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝切除手術(shù)后，肉眼可見再生肝臟明顯小于對照小鼠，同樣發(fā)現(xiàn)肝重/體重比也小于對照組，伴有下降的PCNA標(biāo)記和BrdU摻入；NKT細(xì)胞顯著地聚集在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠再生的肝臟；NKT細(xì)胞分泌IFN-γ和CD69表達(dá)也明顯高于對照小鼠。如果用NK1.

14、1抗體清除NKT細(xì)胞，HBV下降的肝臟再生明顯得到大幅度恢復(fù)，但是只清除NK細(xì)胞卻不能恢復(fù)下降的肝臟再生；在再生早期，肝細(xì)胞表面CD1d顯著上升；血清IFN-γ顯著上升，中和NKT細(xì)胞來源的IFN-γ或者干擾NKT細(xì)胞和CD1d相互作用，可改善下降的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟再生，CD1d阻斷可以阻止上升的血清IFN-γ；外源補(bǔ)充重組小鼠IFN-γ可以顯著加重HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的肝臟再生；外源的IFN-γ刺激抑制了HBV轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的細(xì)胞周期。