RLI1介導(dǎo)的翻譯調(diào)控對(duì)釀酒酵母異源表達(dá)影響.pdf

1、酵母作為真核細(xì)胞工廠，無(wú)論在蛋白質(zhì)累積、生產(chǎn)還是在途徑整合、構(gòu)建的合成生物學(xué)研究中，都占據(jù)著非常重要的地位，其異源表達(dá)調(diào)控自然地成為了研究熱點(diǎn)。以提高酵母異源蛋白表達(dá)量為目標(biāo)，科研人員相繼在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平及翻譯后水平上的調(diào)控進(jìn)行了大量研究，而近年才涉及到翻譯水平的調(diào)控研究。RLI1基因在核糖體生源及其再循環(huán)中起到重要作用，特別是在翻譯終止后RLI1能夠推動(dòng)核糖體解聚再次進(jìn)入翻譯循環(huán)。本文擬通過RLI1基因的表達(dá)從而調(diào)節(jié)相關(guān)環(huán)節(jié)的翻譯

2、過程，來加快核糖體的再循環(huán)，以期緩解異源表達(dá)過程mRNA豐度過高造成的自由核糖體限制問題。
　　首先，我們直接合成了銅離子誘導(dǎo)型的GFP及RFP表達(dá)盒DNA序列，構(gòu)建了基于 YEplac181質(zhì)粒的多拷貝的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化 W303宿主后得到了報(bào)告基因系統(tǒng)。熒光鏡檢結(jié)果表明，兩種報(bào)告基因系統(tǒng)均可在0~100μM Cu2+下啟動(dòng)表達(dá)，但因培養(yǎng)體系中痕量Cu2+存在，在0μM Cu2+下報(bào)告基因仍可啟動(dòng)表達(dá)，為了系統(tǒng)的有效性，最終選取了

3、50μM Cu2+作為誘導(dǎo)劑量；其次，通過生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了GAL1啟動(dòng)子，TEF終止子及RLI1編碼序列信息，在對(duì)其進(jìn)行分析后，設(shè)計(jì)并合成了相關(guān)引物對(duì)，以釀酒酵母W303基因組為模板通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得了各序列，并利用序列兩端的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與低拷貝數(shù)的 YCplac33載體連接，轉(zhuǎn)化 W303宿主后構(gòu)建了本研究的工程菌。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過測(cè)定酵母的生長(zhǎng)曲線，dilution實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡觀察以及流式細(xì)胞儀檢測(cè)等技術(shù)手段研

4、究了RLI1的過表達(dá)對(duì)宿主細(xì)胞的影響。研究表明，與對(duì)照相比，RLI1可控上調(diào)表達(dá)菌株無(wú)論是一般液體培養(yǎng)模式還是在dilution分析中，均表現(xiàn)出明顯的菌體生長(zhǎng)抑制現(xiàn)象；同時(shí)，耗糖實(shí)驗(yàn)表明，不同實(shí)驗(yàn)室流轉(zhuǎn)的 W303菌株之間至少在碳源利用方面存在較大差異，并且可以通過實(shí)驗(yàn)室定向進(jìn)化方法，在較短時(shí)間內(nèi)彌補(bǔ)這種差異，暗示甘油、半乳糖利用相關(guān)基因具有變異快特性；最后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，RLI1上調(diào)表達(dá)可顯著增加異源蛋白GFP在特定誘導(dǎo)區(qū)間內(nèi)的