釀酒酵母耐熱分子調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、微生物高溫發(fā)酵能明顯降低能源消耗和減少環(huán)境污染。本文對(duì)騰沖嗜熱菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)進(jìn)行了主要以熱激蛋白基因?yàn)槟蜔峁δ茉耐诰?，以釀酒酵母中?qiáng)組成型啟動(dòng)子(FBA1p)為調(diào)控元件，通過(guò)單功能、雙功能型2種不同組裝方式進(jìn)行耐熱元器件的設(shè)計(jì)與構(gòu)建。再以載體和基因組整合兩種不同策略將構(gòu)建得到的耐熱元器件導(dǎo)入酵母細(xì)胞中，以期提高釀酒酵母的耐

2、熱性。主要研究結(jié)果如下：
　　通過(guò)梯度升溫(35-45℃)和恒定高溫(42℃)培養(yǎng)初步表征單功能工程菌的耐熱性。研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于騰沖嗜熱菌的泛素和小熱激蛋白基因構(gòu)建的工程菌其耐熱性較好，相比于對(duì)照組，工程菌的OD660值提高了30％以上，細(xì)胞存活率提高了1.5-4.0倍。利用同源重組方法構(gòu)建的耐熱工程菌其OD660值和細(xì)胞存活率比對(duì)照菌株分別提高了21.6%和2.1-3.0倍。
　　生理特性研究表明，耐熱性較好的工程菌相對(duì)于

3、對(duì)照菌株有較好的細(xì)胞壁完整性、較高的海藻糖積累量、較強(qiáng)的抗氧化性、乙醇耐受性和能量代謝。
　　引入不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子進(jìn)行單功能耐熱工程菌的重新構(gòu)建。轉(zhuǎn)錄水平研究表明，菌株的耐熱性強(qiáng)弱與耐熱基因轉(zhuǎn)錄水平的高低相關(guān)。另外，高溫發(fā)酵結(jié)果顯示，利用DNA assemble方法構(gòu)建的雙功能耐熱元器件比單功能元器件能更好的提高酵母的耐熱性。42℃培養(yǎng)條件下，雙功能耐熱釀酒酵母工程菌的乙醇產(chǎn)量比對(duì)照菌株和單功能耐熱工程菌分別提高了47.8%和23

4、.6%。
　　為了對(duì)耐熱元器件進(jìn)行功能驗(yàn)證，我們將較好的耐熱元器件導(dǎo)入β-香樹(shù)脂醇釀酒酵母工程菌和乙醇酵母菌。其中，耐熱β-香樹(shù)脂醇釀酒酵母工程菌的β-香樹(shù)脂醇產(chǎn)量提高了33.4%，酵母的最適生長(zhǎng)溫度拓寬到35℃。耐熱乙醇酵母工程菌的乙醇產(chǎn)量相比對(duì)照菌株提高了10%以上，尤其耐熱乙醇酵母工程菌T.te-IbpA，其乙醇產(chǎn)量提高了35.6%。
　　這項(xiàng)研究通過(guò)提高微生物在較高溫度培養(yǎng)下的合成效率，大大降低了能源消耗和生產(chǎn)成本，