釀酒酵母超長鏈單不飽和脂肪酸生物合成途徑的構(gòu)建.pdf

1、神經(jīng)酸(C24∶1)是一種雙鍵在15號碳上的二十四碳一烯酸，被稱為世界上目前唯一一種具有修復(fù)受損神經(jīng)纖維并促進(jìn)其再生的物質(zhì)，研究表明，神經(jīng)酸可以延緩神經(jīng)衰老，促進(jìn)大腦發(fā)育，對心腦血管病、免疫系統(tǒng)疾病、某些皮膚病等有較好的效果。然而人體很難合成神經(jīng)酸，主要從外界攝入，但是目前神經(jīng)酸產(chǎn)量較低，市場需求較大，因此開發(fā)神經(jīng)酸的生物合成方法具有重要的應(yīng)用價值和理論意義。
　　本課題選用釀酒酵母作為研究對象，通過構(gòu)建產(chǎn)超長鏈單不飽和脂肪酸工程

2、菌，探究了啟動子類型、轉(zhuǎn)錄因子以及外源添加物等對釀酒酵母超長鏈單不飽和脂肪酸合成的影響。
　　1、構(gòu)建FAE1和KCS單基因工程菌，通過發(fā)酵結(jié)果分析，初步確定二者在超長鏈單不飽和脂肪酸延伸過程中的作用。分別采用組成型啟動子PGK和半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1構(gòu)建FAE1和KCS單基因工程菌，發(fā)酵結(jié)果表明:相比半乳糖誘導(dǎo)型啟動子GAL1，組成型啟動子PGK對FAE1和KCS的表達(dá)具有更好的效果;FAE1單基因工程菌最終促進(jìn)了C20∶1

3、和C22∶1的合成，而KCS單基因工程菌可以促進(jìn)C20∶1、C22∶1及C24∶0的合成且C20∶1和C22∶1的含量要低于FAE1基因工程菌，表明FAE1基因在C20∶1和C22∶1的延伸中起主要作用，而KCS基因可能在C24的延伸過程中起主要作用。
　　2、探究多基因聯(lián)合對神經(jīng)酸合成的影響，根據(jù)神經(jīng)酸的生物合成途徑，在單基因工程菌的基礎(chǔ)上構(gòu)建了PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC雙基因工程菌以探究雙基因聯(lián)

4、合作用于超長鏈單不飽和脂肪酸的延伸，同時引入Mga2轉(zhuǎn)錄因子對釀酒酵母不飽和脂肪酸進(jìn)行調(diào)控以加強(qiáng)神經(jīng)酸的合成途徑。發(fā)酵結(jié)果表明，在培養(yǎng)溫度為22℃的條件下培養(yǎng)4天，PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC雙基因工程菌及PTEF1-Mga2-TCYC-PPGK-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC三基因工程菌最終檢測到神經(jīng)酸的生成。與PTEF1-KCS-TCYC-PPGK-FAE1-TCYC雙基因酵母相比，三基

5、因工程菌中神經(jīng)酸含量略有提高。
　　3、優(yōu)化培養(yǎng)條件促進(jìn)超長鏈單不飽和脂肪酸的合成，通過初步探究外源添加不同脂肪酸、蘋果酸、檸檬酸及生物素對神經(jīng)酸合成的影響，發(fā)酵結(jié)果表明了外源添加油酸、蘋果酸及生物素對神經(jīng)酸的合成具有較好的促進(jìn)作用，通過單因素優(yōu)化，最終確定了外源分別添加油酸濃度為1.5mM、蘋果酸濃度為0.2％、生物素濃度為1.5μg/L時，對C22∶1、C24∶1的合成具有較好的促進(jìn)作用，最終使C22∶1分別提高了31％、77