慢加急性肝衰竭內(nèi)毒素血癥對清道夫受體CD163作用的研究.pdf

1、【目的】
　　 探討局限表達(dá)在單核巨噬細(xì)胞系的清道夫受體CD163與血清中可溶性CD163(Scd163)在慢加急性肝衰竭(ACLF)中的臨床表達(dá)和意義，肝衰竭內(nèi)毒素血癥對CD163調(diào)節(jié)免疫的影響以及糖皮質(zhì)誘導(dǎo)CD163表達(dá)對肝衰竭大鼠的保護(hù)作用。
　　 【方法】
　　 1.收集ACLF患者的血清，新鮮血液標(biāo)本，肝移植組織標(biāo)本以及臨床資料。
　　 2.Elisa檢測血清中Scd163,分析Scd163與臨

2、床資料的聯(lián)系。
　　 3.鱟試劑檢測血清中LPS。
　　 4.流式分析儀檢測CD163、HLA-DR分子在外周血單核細(xì)胞的表達(dá)。
　　 5. Real-time PCR檢測外周血單核細(xì)胞CD163，TLR4轉(zhuǎn)錄。
　　 6. LPS體外刺激ACLF患者外周血單核細(xì)胞，Elisa檢測Scd163、TNF-a、IL-10等。
　　 7. HE染色，免疫組化方法檢測 CD163陽性枯否細(xì)胞在ACLF肝組

3、織上的表達(dá)。
　　 8. HE染色，免疫組化觀察糖皮質(zhì)激素對正常大鼠肝組織內(nèi)枯否細(xì)胞表達(dá)CD163分子的影響。
　　 9. 采用全自動生化分析儀器測定肝衰竭大鼠與糖皮質(zhì)激素給藥組大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶，總膽紅素。
　　 10. Elisa測定肝衰竭以及糖皮質(zhì)激素給藥組大鼠血清中Scd163。
　　 11. 采用HE染色觀察肝衰竭大鼠與造模后予以糖皮質(zhì)激素組大鼠肝組織的病理改變。
　　 12．Weste

4、rn blotting分析肝衰竭模型組，造模后立即給藥組（即0h給藥組）、4h給藥組、8h給藥組的肝組織CD163、HO-1的表達(dá)。
　　 【結(jié)果】
　　 1.ACLF患者Scd163水平較肝硬化、慢性乙肝、急性肝炎組和正常組增高（P<0.05）。
　　 2.經(jīng)Pearson相關(guān)分析，ACLF患者入院時(shí)血清Scd163與臨床生化指標(biāo)總膽紅素和反映凝血功能的國際標(biāo)準(zhǔn)化比值呈正相關(guān), (P<0.05)。
　　

5、 3.ACLF患者合并感染或肝腎綜合征或者肝性腦病等并發(fā)癥時(shí)，血清中Scd163水平明顯高于非感染組與無并發(fā)癥組，(P<0.05)。
　　 4.ACLF患者死亡組Scd163水平在入院時(shí)和出院時(shí)均高于存活組(P<0.05), 死亡組病情加重時(shí)，Scd163有增高趨勢；而存活組出院時(shí)Scd163較入院時(shí)有降低的趨勢。
　　 5. ACLF組內(nèi)毒素血癥發(fā)生率以及內(nèi)毒素水平明顯高于肝硬化組、慢性乙肝組、急性肝炎組和正常組，（P

6、<0.05）。
　　 6．繪制LPS與Scd163值的散點(diǎn)圖，內(nèi)毒素血癥與血清中Scd163水平具有一定的相關(guān)性，r=0.56。
　　 7．ACLF患者死亡組外周血單核細(xì)胞體外接受LPS刺激后上清液中TNF-a 低于正常組與存活組，（P<0.05）；而IL-10和Scd163水平高于正常組和存活組，（P<0.05）。
　　 8. ACLF患者死亡組CD163 MFI低于存活組和正常組，（P<0.05）；死亡組中的

7、外周血單核細(xì)胞表面HLA-DR分子表達(dá)最低、存活組次之、正常組（P<0.05）。
　　 9．ACLF患者外周血單核細(xì)胞CD163 Mrna表達(dá)上調(diào)高于慢性重度組、慢性乙肝輕中度組、正常組，（P<0.05）；外周血單核細(xì)胞TLR4 Mrna表達(dá)也上調(diào)，但低于慢性重度組，而高于正常組、慢性輕中度組（P<0.05）。
　　 10. ACLF移植肝組織HE染色后可見：再生肝結(jié)節(jié)內(nèi)肝細(xì)胞廣泛氣球樣變，壞死出現(xiàn)空洞，肝竇內(nèi)可見亮黃色

8、膽栓，以及存在不同程度的肝小葉界面性壞死和纖維化增生，膽小管增生；匯管區(qū)內(nèi)巨噬細(xì)胞多見。
　　 11. ACLF肝組織標(biāo)本免疫組化染色顯示肝竇內(nèi)多見三角形、細(xì)長型、形狀不規(guī)則的染成棕黃色細(xì)胞，即為標(biāo)記的CD163陽性枯否細(xì)胞，正常組織內(nèi)偶可見染成棕色枯否細(xì)胞。
　　 12. 正常組與地塞米松誘導(dǎo)組的大鼠6h后比較：肝組織免疫組化染色顯示地塞米松誘導(dǎo)組CD163陽性枯否細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯增多，而血清中Scd163水平無差

9、異，肝組織結(jié)構(gòu)均完整。
　　 13. 肝衰竭模型組大鼠血清中Scd163水平比給藥組減少，造模后立即給藥組Scd163水平高于4h給藥組、8h給藥組（P<0.05）；
　　 14．造模后給藥組CD163，HO-1表達(dá)較肝衰竭造模組升高，P<0.05；而造模后8h給藥組的CD163，HO-1最高，4h組給藥組次之，立即給藥組CD163與HO-1表達(dá)最低，（P<0.05）。
　　 【結(jié)論】
　　 1．在ACL

10、F患者中血清Scd163顯著增多，明顯高于肝硬化、慢性乙肝、急性肝炎和健康對照組，提示Scd163是ACLF的敏感血清標(biāo)志蛋白；合并腹膜炎的患者Scd163水平增高，提示血清中Scd163的水平與感染相關(guān)，可能是臨床反映感染的指標(biāo)；Scd163與TBIL和INR相關(guān)，一定程度上可以反映ACLF患者的病情。
　　 2．ACLF死亡組患者中，血清Scd163水平明顯高于存活組，死亡組經(jīng)治療后Scd163仍處于較高的水平，存活組在經(jīng)過

11、治療后Scd163呈下降的趨勢，該研究提示Scd163的基礎(chǔ)水平以及治療過程中的變化趨勢可以一定程度上反映ACLF患者的治療效果及預(yù)后。
　　 3.ACLF患者血清Scd163、LPS水平均增高，LPS識別受體TLR4表達(dá)也上調(diào)，Pearson檢驗(yàn)顯示Scd163與LPS水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.56，結(jié)果提示ACLF患者Scd163增高與體內(nèi)內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的機(jī)體感染有關(guān)。
　　 4.ACLF患者中外周血單核細(xì)胞CD

12、163mRNA水平增高，單核細(xì)胞CD163表達(dá)減少，提示血清中Scd163可能一部分來自外周血單核細(xì)胞CD163蛋白水解。
　　 5. 體外用LPS繼續(xù)刺激ACLF患者分離的外周血單核細(xì)胞，結(jié)果顯示死亡組患者分泌TNF-a水平較正常組均減少，而Scd163、IL-10分泌增多；ACLF患者外周血單核細(xì)胞上HLA-DR表達(dá)水平明顯下調(diào)，死亡組患者較存活組和正常組HLA-DR下調(diào)更加顯著，血清中Scd163增高更加顯著，提示在慢性肝

13、病病理基礎(chǔ)上內(nèi)毒素血癥長期刺激可造成ACLF對LPS耐受，患者體內(nèi)存在炎癥反應(yīng)到抗炎反應(yīng)的免疫紊亂，過高的Scd163標(biāo)志著機(jī)體的免疫耐受，耐受的巨噬細(xì)胞使機(jī)體處于癱瘓狀態(tài)，增加了后續(xù)感染的風(fēng)險(xiǎn)，因而過高的Scd163有更高的死亡風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后不良。
　　 6．我們的結(jié)果證實(shí)糖皮質(zhì)激素在體內(nèi)可以誘導(dǎo)肝內(nèi)表達(dá)CD163的枯否細(xì)胞增多，造模后立即給藥組及4h給藥組對急性肝衰竭大鼠有保護(hù)作用，而血清中Scd163明顯增多，提示早期給予糖皮