非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重鏈A蛋白在PRRSV感染細(xì)胞中的作用.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）歸屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科屬，由該病毒引起的豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）已成為世界養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)中主要疫病之一。該病主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道癥狀和高死亡率。目前PRRS已經(jīng)遍及全球主要養(yǎng)豬的國家和地區(qū)，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PRRSV侵入宿主細(xì)胞首先通過與細(xì)胞膜表面上的特異性受體結(jié)合，利用細(xì)胞內(nèi)吞作用而感染易感細(xì)胞?，F(xiàn)已報(bào)道的PRRSV感染

2、Marc-145細(xì)胞的受體有CD163和Vimentin。CD163屬于富含半胱氨酸超家族的清道夫受體蛋白，不但能夠結(jié)合PRRSV，還能介導(dǎo)病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。Vimentin是一個(gè)普遍存在于細(xì)胞內(nèi)的波形蛋白，單克隆抗波形蛋白抗體可以阻斷PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染，對(duì)PRRSV非易感的BHK-21和CRFK細(xì)胞在表達(dá)了猴的波形蛋白之后變成了PRRSV易感細(xì)胞，同時(shí)波形蛋白與其它中間細(xì)絲蛋白組成的多聚體可能參與PRRSV在細(xì)胞

3、內(nèi)的復(fù)制和轉(zhuǎn)移。我的導(dǎo)師周恩民教授利用所制備的針對(duì)PRRSV GP5蛋白的單克隆抗獨(dú)特型抗體（Mab2-5G2），從PRRSV易感細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)可能的PRRSV細(xì)胞受體蛋白。該蛋白為非肌肉肌球蛋白II型重鏈A（non-muscle myosin heavy chain II-A，NMHC II-A）。NMHC II-A廣泛存在于自然界。在哺乳動(dòng)物中，它是非肌肉肌球蛋白II型（NM II）重鏈的一個(gè)亞型，在整個(gè)細(xì)胞周期，包括細(xì)胞遷移、胞

4、質(zhì)分裂、細(xì)胞吸附和細(xì)胞形態(tài)變化過程中發(fā)揮重要的作用。已有研究證明NMHC II-A與T細(xì)胞上的趨化因子受體CXCR4 結(jié)合，從而介導(dǎo)趨化因子的信號(hào)傳導(dǎo)，可溶性CD163蛋白通過與T細(xì)胞上NMHC II-A的協(xié)同作用而結(jié)合T細(xì)胞，這些都說明了NMHC II-A在免疫反應(yīng)中的作用。
　　 本文研究了NMHC II-A對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的阻斷作用。首先根據(jù)NMHC II-A羧基端基因序列人工合成七條多肽，通過病毒中和

5、實(shí)驗(yàn)證明其中三條多肽對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞有阻斷作用。為探求NMHC II-A羧基端的生物學(xué)功能，從Marc-145細(xì)胞中提取總RNA，利用特異性引物，經(jīng)RT-PCR克隆得到NMHC II-A羧基端基因（命名為PRA）。將PRA連接至pET-28a(+)原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到重組的NMHC II-A羧基端蛋白(命名為PRA蛋白)。經(jīng)分段表達(dá)蛋白，Western-blot和I-ELISA實(shí)驗(yàn)證明了PRA蛋白能與Mab2

6、-5G2特異性結(jié)合，并且找到了比較準(zhǔn)確的結(jié)合位點(diǎn)。通過間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明了PRA蛋白能夠與Marc-145細(xì)胞的細(xì)胞膜特異性結(jié)合。更重要的是，通過病毒中和實(shí)驗(yàn)，熒光病毒中和實(shí)驗(yàn)，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)證明了PRA蛋白能夠在一定程度上阻斷PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的感染。將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PRA轉(zhuǎn)染至Marc-145細(xì)胞，與未轉(zhuǎn)染的Marc-145細(xì)胞相比，PRRSV感染轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-PRA的Marc-145細(xì)胞的能