MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其機(jī)制的實驗研究.pdf

1、背景:
　　創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是一種日益增多的公共衛(wèi)生問題，涉及到巨大的社會成本，是全世界致殘率和致死率最主要的病因，尤其是兒童和青少年。TBI是一個漸進(jìn)性的病理生理過程紊亂事件。最初，受傷當(dāng)時的機(jī)械力損傷，可以導(dǎo)致神經(jīng)元、軸索、膠質(zhì)細(xì)胞和血管的直接機(jī)械性損傷。在原發(fā)性損傷后立即啟動一系列連續(xù)性復(fù)雜的病理生理過程，觸發(fā)大量的繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致漸進(jìn)性組織損傷和細(xì)胞死亡，又稱

2、繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷后數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)啟動，可持續(xù)到數(shù)月或數(shù)年。繼發(fā)性損傷是TBI后神經(jīng)退行性變和神經(jīng)功能障礙的最重要的原因。
　　一個重要的遲發(fā)性損傷機(jī)制涉及到細(xì)胞周期激活(cell cycle activation，CCA)，導(dǎo)致成熟的神經(jīng)元和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。研究表明，在TBI后，在腦組織中可檢測到細(xì)胞周期活化標(biāo)記物的表達(dá)明顯增高，如Cyclin D1，CDK4，E2F5，c-

3、myc，和PCNA。MCMs是DNA復(fù)制過程中必不可少的重要物質(zhì)，是啟動細(xì)胞周期S期的許可成分，并且能夠進(jìn)一步使DNA從復(fù)制叉中的超螺旋狀態(tài)發(fā)揮微弱的解鏈酶作用。MCM7是高度保守的微小染色體維持蛋白家族成員之一，對于基因組復(fù)制的啟動是必須的。MCM7cDNA編碼一個543個氨基酸蛋白，在所有組織中均有表達(dá)。CD147，或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(EMMPRIN)是一種跨膜糖蛋白，也稱為Basigin(BSG)，是由Basigin基因

4、編碼。CD147是免疫球蛋白超級家族成員，主要組成了兩個細(xì)胞外免疫球蛋白域（C和V）。CD147在許多組織和細(xì)胞中表達(dá)，最先被發(fā)現(xiàn)存在于實體瘤細(xì)胞表面。CD147通過自主分泌和旁分泌方式刺激產(chǎn)生MMPs。在病理生理情況下，MMPs以蛋白水解的形式降解各種ECM中的成分和BBB的緊密連接蛋白，引起B(yǎng)BB破壞。
　　基于上述資料，似乎MCM7和CD147可能涉及到TBI后的病理生理和生物化學(xué)過程，然而，在TBI中MCM7和CD147的

5、表達(dá)和可能的作用尚未明確。我們本實驗的目的是想通過研MCM7和CD147的表達(dá)及其相互作用，來進(jìn)一步明確MCM7、CD147與腦損傷后神經(jīng)病理性改變的關(guān)系。
　　第一部分 MCM7在大鼠TBI中的表達(dá)變化及其作用機(jī)制的實驗研究
　　目的：通過建立成年鼠的TBI模型來研究MCM7在大鼠TBI后的表達(dá)的變化規(guī)律，并在細(xì)胞水平探討MCM7的功能及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和修復(fù)中的細(xì)胞和分子機(jī)制中的作用獲得更深的理解。
　　方法：

6、健康雄性的S-D大鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組在右側(cè)皮層正中線旁開3mm處層做一個前后軸向外科切口。假手術(shù)組麻醉和外科準(zhǔn)備后，只打開顱骨，而不進(jìn)行皮層損傷。采用Western blot法檢測腦創(chuàng)傷后組織中的MCM7、PCNA及Caspase-3的表達(dá)。利用免疫組織化學(xué)法對MCM7在大鼠腦組織中的表達(dá)變化。然后通過雙免疫熒光標(biāo)記法，進(jìn)一步驗證MCM7在創(chuàng)傷性腦損傷中的空間表達(dá)特征。
　　結(jié)果：1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，

7、Western blot法MCM7在腦皮層組織中的表達(dá)變化
　　蛋白免疫印跡法顯示在損傷周圍大腦皮層中，在正常和假手術(shù)組的皮層中MCM7的表達(dá)水平相對較低。但是在TBI損傷后12小時，損傷周圍大腦皮層中MCM7的表達(dá)逐漸增加，在第3天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，在TBI后第28天，MCM7的表達(dá)恢復(fù)到基線正常水平。而在正常組和假手術(shù)組中，MCM7的表達(dá)水平?jīng)]有任何變化。這些資料提示MCM7蛋白的表達(dá)水平在TBI后發(fā)生了時間上的變化。<

8、br>　　2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，免疫組織化學(xué)法MCM7在腦皮層組織中的表達(dá)變化
　　結(jié)果顯示，在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細(xì)胞的胞漿內(nèi)MCM明顯增多。然而，在對側(cè)半球的同側(cè)部位和未受損傷的假手術(shù)組中的腦組織中陽性染色較少。進(jìn)一步放大倍數(shù)清晰地顯示，陽性染色的分布和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，在創(chuàng)傷性腦損傷后3天，在同側(cè)受損的腦組織皮層中MCM7的表達(dá)明顯高于損傷對側(cè)半球和假手術(shù)組。定量分析顯示，創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對側(cè)和同側(cè)中，每平方

9、毫米MCM7陽性細(xì)胞數(shù)在損傷側(cè)大腦皮層中MCM7表達(dá)明顯增高。
　　3、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，雙免疫熒光標(biāo)記法MCM7與損傷后不同特異性標(biāo)記物表型的共定位
　　我們發(fā)現(xiàn)，MCM7在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中均廣泛表達(dá)。有趣的是，同假手術(shù)組相比，MCM7在受損的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位是變化的。MCM7出現(xiàn)在假手術(shù)組腦組織中的神經(jīng)元的神經(jīng)核、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中。然而，在創(chuàng)傷3天后

10、，MCM7在受損腦組織的神經(jīng)核和胞漿內(nèi)有表達(dá)。結(jié)合上述資料實驗資料結(jié)果，我們推測MCM7可能參與了TBI后細(xì)胞周期的調(diào)控從而參與了神經(jīng)元的凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為。
　　結(jié)論：
　　1、MCM7在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達(dá)具有時間和空間的特征性變化規(guī)律:MCM7在顱腦損傷12小時后其表達(dá)水平逐漸升高，在3天時達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，并在28天恢復(fù)至正常水平。
　　2、MCM7在大鼠受損的腦皮層組織中MCM7

11、在受損腦組織的神經(jīng)核和胞漿內(nèi)有表達(dá)。
　　3、MCM7在蛋白水平的表達(dá)具有特征性變化，這種變化和caspase-3的變化具有一致性。提示MCM7在腦外傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡方面具有一定作用，它具有促凋亡的生物學(xué)特性。
　　4、MCM7在蛋白表達(dá)水平有特征性變化，這種變化及PCNA的變化具有一致性。提示MCM7可能參與了大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。
　　5、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的分子生物學(xué)變化與MCM7的生物學(xué)活性具有

12、相關(guān)性。
　　6、MCM7在大鼠腦外傷后受損的皮層中有特定的時間和空間表達(dá)模式。提示MCM7可以作為神經(jīng)元損傷的重要的生物標(biāo)記物。
　　第二部分 MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其作用機(jī)制的實驗研究
　　目的：通過建立成年鼠的TBI模型，來研究CD147在大鼠腦損傷后的表達(dá)的變化規(guī)律，并通過研究MCM7和CD147的相互作用，來進(jìn)一步明確MCM7與腦損傷后神經(jīng)病理性改變的關(guān)系。
　　方法：健康雄性的

13、S-D大鼠，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組在右側(cè)皮層正中線旁開3mm處層做一個前后軸向外科切口。假手術(shù)組麻醉和外科準(zhǔn)備后，只打開顱骨，而不進(jìn)行皮層損傷。采用Western blot法檢測腦創(chuàng)傷后組織中的CD147的時間的表達(dá)變化。利用免疫組織化學(xué)法監(jiān)測CD147在大鼠腦組織中空間表達(dá)變化。然后通過雙免疫熒光標(biāo)記染色顯微鏡法檢測CD147在皮層組織中的定位情況。
　　結(jié)果：
　　1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，CD147在腦

14、皮層組織中的表達(dá)變化
　　蛋白免疫印跡顯示在損傷周圍大腦皮層中，在正常和假手術(shù)組的皮層中CD147的表達(dá)水平相對較低。但是在TBI損傷后12小時，損傷周圍大腦皮層中CD147的表達(dá)逐漸增加，在第3天達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，在TBI后第28天，CD147的表達(dá)恢復(fù)到基線正常水平。而在正常組和假手術(shù)組中，CD147的表達(dá)水平?jīng)]有任何變化。這些資料提示CD147蛋白的表達(dá)水平在TBI后發(fā)生了時間上的變化(temporally chang

15、e)。這種改變與MCM7的在顱腦損傷后的改變是一致的。說明這兩者可能存在一定的相互作用。
　　2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后，免疫組織化學(xué)法CD147在腦皮層組織中的表達(dá)變化
　　我們選擇在TBI后3天作為免疫組織化學(xué)法染色的時間截點，因此時CD147的表達(dá)達(dá)到高峰值。結(jié)果顯示，在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細(xì)胞的胞漿內(nèi)CD147明顯濃聚。然而，在對側(cè)半球的同側(cè)部位和未受損傷的假手術(shù)組中的腦組織中陽性染色較少。
　　進(jìn)一步放大倍

16、數(shù)清晰地顯示，陽性染色的分布和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，在創(chuàng)傷性腦損傷后3天，在同側(cè)受損的腦組織皮層中CD147的表達(dá)明顯高于損傷對側(cè)半球和假手術(shù)組。定量分析顯示，創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對側(cè)和同側(cè)中，每平方毫米CD147陽性細(xì)胞數(shù)在同側(cè)大腦皮層中MCM7表達(dá)明顯增高。
　　結(jié)論:
　　1、CD147在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達(dá)具有時間和空間的特征性變化規(guī)律:與MCM7的表達(dá)變化具有一致性。
　　2、MCM7與CD147在腦損