糖基化CD147調節(jié)心肌膠原交聯度的作用及其機制研究.pdf

1、【背景】
　　高血壓是心血管病(cardiovascular disease,CVD)重要的獨立危險因素之一,它導致的心肌肥大并最終轉化為心力衰竭嚴重制約了CVD的臨床防治效果。心肌膠原交聯度降低是誘導心肌肥大向心力衰竭轉化的關鍵因素,然而對于間質纖維化程度不斷增高的肥大心肌,其膠原交聯度的變化存在諸多爭議,且心肌膠原交聯度降低的機制更不是十分清楚。CD147是免疫球蛋白超家族的成員之一,其糖基化程度增加時,可激活基質金屬蛋白酶(

2、matrix metalloproteinase,MMP),進而影響膠原交聯度。研究表明,CD147與心肌缺血-再灌注損傷、鈣化性主動脈瓣狹窄、心力衰竭等多種CVD相關,且血管緊張素II(angiotensin II,Ang II)能夠誘導多種細胞的CD147表達上調、糖基化程度增強。因此,本實驗采用腎性高血壓誘導心肌肥大,證實糖基化CD147是調節(jié)心肌膠原交聯度的關鍵因素,并闡明其可能機制;同時,揭示心肌局部Ang II對CD147的

3、表達量與糖基化程度的調節(jié)機制。
　　【目的】
　　借助腎性高血壓引起的慢性壓力超負荷與Ang II含量增加誘導的心肌肥大大鼠模型,闡明心肌局部高濃度的Ang II導致CD147的表達與糖基化程度增加,進而激活MMP,促進心肌間質纖維化,同時降低心肌膠原交聯度的機制。有望為臨床防治高血壓導致的心肌肥大向心力衰竭的轉化提供理論依據與干預新靶點。
　　【方法】
　　首先,本實驗采用Goldblatt兩腎一夾(two-k

4、idney one-clip,2K1C)大鼠模型模擬腎性高血壓導致的心肌肥大,通過生理學、形態(tài)學、生物學、生物化學、醫(yī)學影像學等多重指標對2K1C大鼠進行系統性評估,運用Western blot與植物凝血素植物血球凝集素-L(phytohemagglutinin-L,PHA-L)染色檢測肥大心肌不同時期 CD147的表達與糖基化水平。
　　然后,給予模型動物 CD147的糖基化酶β1,6-N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶-V(β1,6-N

5、-acetylglucosaminyl transferase-V,GnT-V)的抑制劑衣霉素或活化劑維甲酸,運用Western blot、免疫熒光組織化學與植物凝血素PHA-L染色檢測心肌CD147的表達與糖基化水平,采用明膠酶譜測定MMP-2和-9的活性,Masson染色及羥基脯氨酸含量測定觀察心肌間質纖維化程度與膠原含量,并檢測心肌膠原交聯度的變化。
　　最后,給予模型動物1型血管緊張素受體(angiotensin rece

6、ptor type1,AT1)拮抗劑氯沙坦,依然檢測心肌CD147的表達與糖基化水平。進一步分離并培養(yǎng)新生大鼠心肌細胞(neonatal rat cardiomyocyte,NRCM),Ang II、氯沙坦、2型血管緊張素受體(angiotensin receptor type2,AT2)拮抗劑PD123319、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)抑制劑十字孢堿、PKC活化劑12-十四酸佛波酯-13-乙酸鹽（phorb

7、ol12-myristate13-acetate,PMA)、衣霉素或維甲酸處理后,檢測NRCM CD147的表達與糖基化水平。
　　【結果】
　　(1)2K1C大鼠心肌CD147表達與糖基化進行性升高
　　2K1C大鼠的心臟結構與功能呈現時間依賴性改變。頸動脈插管測量血壓顯示,2K1C大鼠血壓呈進行性升高,術后1 w血壓即明顯升高,8 w時收縮壓(systolic blood preasure,SBP)已經超過200

8、mmHg。ELISA結果提示,2K1C大鼠血漿Ang II濃度在術后1 w即達到峰值,并維持在較高水平;同樣,心肌Ang II濃度在達到峰值后始終維持在較高水平。在系統性評價心臟結構與功能時選用了多重指標進行全面分析。首先,運用ELISA檢測心肌肥大標志物心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP),結果表明,2K1C大鼠術后心肌組織ANP濃度始終維持在較高水平。其次,由大體觀察與心臟四腔切面可見,2K1C

9、大鼠術后4 w開始出現心臟增大、室間隔和心室壁明顯增厚、心腔縮小等特征,且生物學測量進一步證實了這一結果。另外,左心室、右心室的心室重量/心臟重量(ventricle weight/heart weight,VW/HW)均無統計學差異。不僅如此,組織病理學檢查提示,2K1C大鼠4 w后心肌纖維增粗,統計結果顯示單個心肌細胞直徑明顯增大。再次,超聲心動圖檢查提示,表征心臟舒張功能的左心室縮短率(fractional shortening,

10、FS)和收縮功能的左心室射血分數(ejection fraction,EF)稍有降低,但并未達到心力衰竭的標準。與此同時,2K1C大鼠與Sham大鼠的肺臟重量/體重(lung weight/body weight,LungW/BW)、肝臟重量/體重(liver weight/body weight,LiverW/BW)、肺臟與肝臟干重/濕重(dry weight/wet weight,Wd/Ww)均無統計學差異。最后,Masson染色及

11、羥基脯氨酸含量測定表明,與Sham大鼠相比,2K1C大鼠心肌間質纖維化逐漸增強,心肌膠原含量呈進行性增加。另外,大體觀察及生物學測量顯示,2K1C導致腎動脈縮窄側腎臟術后體積與重量逐漸減小,左腎重量/右腎重量(left kidney weight/right kidney weight,LKW/RKW)逐漸降低,即2K1C導致腎動脈縮窄側腎臟術后逐漸萎縮,這也是2K1C模型的標準之一。
　　2K1C大鼠心肌 CD147的表達量進行

12、性升高,其糖基化水平也逐漸增強。由于2K1C大鼠血壓、心肌肥大程度、間質纖維化水平及 CD147表達量均呈現進行性改變趨勢,因此采用Pearson相關分析評估CD147表達量與血壓、心肌肥大及間質纖維化程度之間的關系。結果表明,CD147表達水平與血壓、心肌肥大及間質纖維化程度均呈正相關。而進一步的受試者工作特征(receiver operator characteristic,ROC)分析則證實了CD147表達量可能具備一定的診斷能力

13、。ROC分析顯示,CD147表達量能夠診斷高血壓、心肌肥大及間質纖維化。
　　(2)糖基化CD147參與調節(jié)心肌膠原交聯度
　　從整體來看,本實驗中使用的GnT-V抑制劑衣霉素或活化劑維甲酸對2K1C大鼠的血壓和心肌組織Ang II濃度并無明顯影響。對心臟而言,衣霉素或維甲酸處理的Sham大鼠的心臟大小并無明顯改變,但衣霉素處理的2K1C大鼠心臟縮小,而維甲酸處理的心臟增大。進一步的生物學測量表明,由于衣霉素明顯降低大鼠BW

14、,衣霉素處理的Sham與2K1C大鼠心臟重量/體重(heart weight/body weight,HW/BW)顯著升高,且高于相應的Sham或2K1C大鼠,造成心肌肥大的假象。超聲心動圖檢查提示,維甲酸降低2K1C大鼠的左心室EF值。Western blot結果顯示,衣霉素使2K1C大鼠心肌 CD147表達降低,而維甲酸則使其增加。同樣,免疫熒光組織化學染色顯示,衣霉素使2K1C大鼠心肌CD147在心肌細胞膜上的分布減少,而維甲酸則

15、使其增加。進一步的植物凝集素PHA-L染色提示,衣霉素使Sham及2K1C大鼠心肌糖基化程度減弱,而維甲酸使其糖基化程度增強。于是,我們進一步檢測心肌膠原交聯度,結果發(fā)現,衣霉素對2K1C大鼠心肌膠原交聯度并無明顯影響,而維甲酸則使其下降。
　　明膠酶譜結果顯示,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性增強,給予衣霉素后,2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活性均下降,相反,給予維甲酸時,Sham與2K1C大鼠心肌MMP-2和-9的活

16、性升高。
　　(3)Ang II經AT1、PKC、GnT-V促進CD147糖基化
　　給予氯沙坦后,血壓測量、ELISA、大體觀察與生物測量提示,氯沙坦能有效降低2K1C大鼠的血壓、延緩心肌肥大。Western blot與免疫熒光組織化學結果顯示,氯沙坦可降低2K1C大鼠心肌CD147的表達,進一步的植物凝集素PHA-L染色提示,給予氯沙坦能夠減弱2K1C大鼠心肌細胞膜上的糖基化程度。離體實驗結果表明,AT1拮抗劑氯沙坦、P

17、KC抑制劑十字孢堿、GnT-V抑制劑衣霉素可降低Ang II處理的NRCM CD147的表達水平及糖基化程度,AT2拮抗劑PD123319對兩者均無影響,而PKC活化劑PMA與GnT-V活化劑維甲酸可增加NRCM CD147的表達水平及糖基化程度。
　　【結論】
　　本實驗初步闡釋了糖基化 CD147參與調節(jié)心肌膠原交聯度,其可能的機制是Ang II誘導CD147表達與糖基化程度增加,進而激活MMP,促進心肌間質纖維化,同時