NA蛋白氨基酸位點突變對H9N2亞型AIV傳播特性和致病力的影響.pdf

1、近幾年來，禽流感病毒(Avian Influenza，AIV)在全世界范圍內流行，是養(yǎng)禽業(yè)面臨的一個巨大挑戰(zhàn)。其中H9N2亞型AIV是目前亞洲分布最為廣泛的一個低致病性禽流感亞型。雖然低致病性禽流感病毒在臨床上主要表現(xiàn)為死亡率不高，但是當和其他細菌、病毒微生物共感染時，容易導致疫病的發(fā)生，繼而出現(xiàn)較高的發(fā)病率和死亡率;該亞型病毒也能夠感染人引起人的呼吸系統(tǒng)感染和結膜炎等，即屬于人獸共患病病原。研究發(fā)現(xiàn)，中國大陸1998年H9N2亞型禽流

2、感病毒大流行的原因是因為病毒獲得了氣溶膠傳播的特性，并且其傳播特性和致病能力可能是NA基因結構決定。然而，在NA基因水平上對氣溶膠傳播及致病力的研究甚少，因此本實驗利用反向遺傳技術構建重組病毒，然后利用H.E染色及免疫組化技術和氣源性傳播實驗模型研究H9N2亞型AIV氣源性傳播及其致病力之間的差異。
　　一、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒的拯救
　　本實驗通過基因克隆的方法，利用自己優(yōu)化設計的帶有Bsm

3、BⅠ/AarⅠ/BsaⅠ酶切位點的引物以及Webster贈送的流感病毒8質粒系統(tǒng)反向遺傳雙向轉錄/表達載體pHW2000，構建出含有PolⅠ-PolⅡ系統(tǒng)的SD01株的8個轉錄/表達質粒以及SS94株NA基因轉錄/表達質粒。利用基因定點突變技術分別對SS94株的NA基因381、313、368和370氨基酸位點通過PCR技術定點突變，測序后驗證得到含有D381G、K313E、E368D、L370S突變位點的NA基因。然后將SD01株的7個

4、基因轉錄/表達質粒分別和SS94株NA基因轉錄/表達質粒(pHWSS6-NA)及SS94株NA基因含有突變位點的轉錄/表達質粒(pHWSS6-NA381)共同作用細胞板中的293T細胞，分別拯救出R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒。通過測序對比，證明獲得目的重組病毒。分別將兩株重組病毒株接種9～11日齡健康SPF雞胚，增強復制能力并用Reed-Muench方法計算EID50以用來測定其毒力。R01/NASS株EID50

5、為8.17±0.20/mL，R01/NASS-381株EID50為9.43±0.40/mL，雖R01/NASS-381株毒力大于R01/NASS株，差異不顯著。
　　二、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒氣源性傳播的研究
　　利用SPF雞正負壓隔離器，以30只4周齡健康SPF雞為實驗動物，隨機等量的分為攻毒組、直接接觸組和氣溶膠間接感染組三組，以此模型分別測定R01/NASS和R01/NASS-381重組株

6、病毒在雞群間的傳播特性。在攻毒組通過點眼滴鼻接種病毒后24h后放入直接接觸組，從第2天開始每隔一天收集一次口咽泄殖腔棉拭子樣品，直至第14天;處理棉拭子樣品接種9日齡健康SPF雞胚，通過HA/HI試驗測定棉拭子AIV的病毒含量;第4、6、8、10、14天，用AGI-30收集隔離器中空氣樣品，同樣接種9日齡健康SPF雞胚，測定空氣中病毒的含量;接種病毒第7天、14天、21天分別采取血樣，處理后通過HA/HI試驗測定病毒效價。試驗結果表明，

7、接種R01/NASS-381株病毒的傳播試驗，氣溶膠間接接觸組雞群口咽泄殖腔棉拭子檢測到病毒并且血樣中檢測抗體效價，同時也檢測到空氣中氣載型AIV的存在，接種第6天檢測到病毒，第8天達到高峰，以后逐漸降低。接種R01/NASS株病毒的傳播試驗中，只在攻毒組和直接接觸組口咽泄殖腔棉拭子檢測到病毒以及血樣中檢測到抗體。氣溶膠間接感染組抗體陰性;未收集到氣載型AIV顆粒;口咽泄殖腔棉拭子均未檢測到病毒存在。傳播試驗說明，拯救的R01/NASS

8、病毒株未獲得氣源性傳播的能力;然而通過SS94株NA蛋白基因D381G、K313E、E368D、L370S位點突變后，重組R01/NASS-381病毒株獲得了在家禽間氣源性傳播的能力。因此說明了H9N2亞型AIV的NA蛋白381、313、368和370位氨基酸對病毒能否在家禽間氣源性傳播起到至關重要的作用。
　　三、R01/NASS和R01/NASS-381重組株病毒致病性的研究
　　取15只4周齡健康SPF雞隨機分為3組，

9、將兩株重組病毒分別接種5只，攻毒組通過點眼、滴鼻方式滴加106 EID50雞胚尿囊液0.2mL/只，對照組同種方式接種等量的無菌生理鹽水。隔離飼養(yǎng)3天后，全部剖殺取心、肝、脾、肺、腎、腦、氣管、胰腺、法氏囊等組織，對照組和接毒組分別做好標記。分別固定于4％多聚甲醛中，通過H.E染色和免疫組化觀察各組織病變以及抗原分布情況。結果發(fā)現(xiàn)，對照組通過H.E染色后，鏡下觀察無任何組織病變，免疫組化同樣也無任何棕色區(qū)域。接種R01/NASS和R01

10、/NASS-381重組株病毒的兩個實驗組肺臟、腎臟和肝臟均出現(xiàn)病理變化，接種R01/NASS-381重組株病毒的SPF雞其呼吸道、氣管、支氣管及肺部淋巴細胞浸潤、充血及出血現(xiàn)象比接種R01/NASS重組株病毒的SPF雞明顯。然而其他組織前者都有一定的病變，而后者病理變化極微弱;同樣免疫組化結果對比發(fā)現(xiàn)，只能在接種R01/NASS-381重組株病毒的SPF雞的肺臟、肝臟和腎臟中陽性信號明顯多于R01/NASS重組株，對照組檢測不到任何信號