特異氨基酸位點對Vip3Aa18殺蟲功能的影響.pdf

1、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, 簡稱Bt)是應用最成功最廣泛的微生物殺蟲劑,但近年來抗性問題卻嚴重影響了Bt的應用和發(fā)展。營養(yǎng)期殺蟲蛋白(vegetative insecticidal protein, 簡稱VIPs)是一種全新的殺蟲物質,與任何已知的殺蟲晶體蛋白沒有同源性,其殺蟲機理也不同于已知的殺蟲晶體蛋白。VIPs蛋白單獨或是與Cry蛋白共同使用,或是組建融合基因構建工程菌,都將極大地擴大Bt的殺蟲

2、譜、提高毒力,同時還可以抑制害蟲抗性的產生。 本文以本實驗室提交到GenBank的vip3Aa18基因及其構建菌株為實驗材料,運用生物信息學軟件分析了Vip3Aa18蛋白的二硫鍵位點、結合域、蛋白酶水解位點等位點和功能區(qū)。預測結果顯示,Vip3Aa18蛋白的第292位和401位的半胱氨酸能形成一個二硫鍵；C端(Aa539-Aa666)位置存在一個糖結合域；198和455位的蛋白酶水解位點可能與形成毒性核心片段有關。用定點突變技術

3、構建了相應氨基酸位點的突變菌株：與二硫鍵有關的C401G、C507G、C401G&C507G突變菌株,與結合域有關的N555I、T570I、T570S、Y616A、Y629S、D660G突變菌株,與蛋白酶水解位點有關的K198D、K455N、K198D&K455N突變菌株(數字代表Vip3Aa18上突變的氨基酸位點,突變后位點前面的氨基酸變?yōu)楹笳?。將突變菌株進行誘導表達,并用甜菜夜蛾進行生物活性測定,與原始Vip3Aa18菌株的殺蟲毒

4、力進行比較,結果發(fā)現(xiàn)： 1.在Vip3Aal8內共有三個半胱氨酸(292位、401位、507位),軟件預測292&401位能形成一個二硫鍵。生物活性測定顯示C401G和C401G&C507G菌株對甜菜夜蛾幾乎完全失去了殺蟲活性,而C507G菌株的殺蟲活性和原始Vip3Aal8菌株沒有顯著差異。生物活性測定結果與軟件預測結果相符。所以,我們認為Vip3Aa18蛋白的292&401位能形成二硫鍵,并且二硫鍵在維持Vip3Aa18蛋白

5、的高級結構及其毒性方面非常重要。 2.結合域內的T570I、T570S、Y629S、D660G突變菌株對甜菜夜蛾的殺蟲活性也幾乎完全丟失,而N555I和Y616A突變菌株的殺蟲毒力與原始Vip3Aal8菌株基本相同,說明Vip3Aa18蛋白的570位、629位和660位氨基酸是結合域內的關鍵位點,在Vip3Aa18蛋白對甜菜夜蛾的殺蟲作用中扮演了重要角色。 3.軟件預測Vip3Aal8蛋白的198位和455位是潛在的蛋白

6、酶水解位點,兩個位點正常水解后能形成毒性核心片段,若不正常水解可能影響Vip3Aal8的殺蟲活性,但生物活性測定結果顯示K198D、K455N及K198D&K455N突變菌株對甜菜夜蛾的殺蟲毒力與原始Vip3Aal8菌株相比均沒有顯著性差異,說明這兩個水解位點的突變并不影響Vip3Aal8菌株的殺蟲活性。在198位和455位附近還有其它水解位點,能影響殺蟲活性的水解位點可能在它們附近。 本研究首次確定了二硫鍵的位置并證實了其對V