AIV鑒定、擴增及測序引物的優(yōu)化和應用及H9N2亞型AIV對哺乳動物潛在危害的分子基礎研究.pdf

1、亞型鑒定是禽流感病毒研究的一項基礎而重要的工作。由于禽流感病毒的不斷進化，給禽流感病毒的診斷工作帶來了新的問題。目前常用的亞型鑒定方法是RT-PCR反應，而引物決定RT-PCR反應的特異性和靈敏性。為適應禽流感病毒的變異，RT-PCR反應中使用的引物需要不斷的更新。
　　因H5、H7、H9、H3、H4和H6，N1、N2、N6、N8及N9為目前流感病毒的優(yōu)勢亞型，根據本實驗室已有的及GeneBank中的序列，進行比對，使用Prime

2、r5軟件設計這些亞型的HA和NA的通用擴增引物及特異性的鑒定引物。禽流感病毒的內部基因相對比較保守，下載各亞型禽流感病毒的六個內部基因序列，比對后，設計通用引物。在測序方面，采用一對M13F/M13R引物替代之前的分節(jié)段測序引物。
　　采用優(yōu)化的引物對2013-2015年邊境省份的禽流感流行病學調查中分離到的41株禽流感病毒進行了亞型鑒定和序列測定。包括5株H5N6亞型、2株H5N1亞型、10株H3N2亞型及24株H9N2亞型。對

3、41株病毒株進行全基因組測序分析發(fā)現：5株H5N6亞型禽流感病毒集中于clade2.3.4.4分支；2株H5N1亞型禽流感病毒屬于clade2.3.2.1c分支；10株H3N2亞型禽流感病毒均處于歐亞禽源病毒分支；24株H9N2亞型禽流感病毒都分布在BJ/1/94亞群。關鍵氨基酸位點分析發(fā)現：所有H5亞型病毒HA蛋白裂解位點均有多個連續(xù)的堿性氨基酸，符合HPAIV的特征；所有H3和H9亞型病毒HA蛋白裂解位點均不含有多個連續(xù)的堿性氨基酸

4、，符合LPAIV的特征。同源性分析發(fā)現：2株從虎體內分離到的H5N1亞型禽流感病毒為重組病毒，其內部基因由H9N2亞型禽流感病毒提供。
　　H9N2禽流感病毒為感染人的流感病毒，如1997年的香港H5N1禽流感病毒、2013年的H7N9及H10N8禽流感病毒，這些新型重組病毒提供了內部基因片段，并在新型禽流感病毒的產生中起重要作用。H9N2亞型禽流感病毒在我國流行甚廣，本實驗室近年來從哺乳動物體內分離到了多株H9N2亞型禽流感病毒

5、。為探究H9N2亞型禽流感病毒對哺乳動物的致病機制，選取Civet/GX/S9/13（H9N2）病毒株在小鼠上進行了致病性和適應性研究。原代Civet/GX/S9/13（H9N2）僅在BALB/C鼠的肺臟和鼻甲骨中呈較低程度的復制，對小鼠不致死，呈低致病性。將該病毒在BALB/C鼠體內繼代感染，其在小鼠的肺臟和鼻甲骨中復制滴度增高，第8代病毒致死BALB/C鼠，對BALB/C鼠的致病性增強。分析繼代感染病毒的氨基酸位點，發(fā)現只有PB2蛋