CGMMV外殼蛋白和復(fù)制相關(guān)蛋白基因突變體致病性分析.pdf

1、黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)是葫蘆科作物上的重要病毒之一，給葫蘆科作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的威脅。近十年來(lái)，CGMMV在世界范圍內(nèi)的蔓延范圍仍在不斷擴(kuò)大。本文以CGMMV不同突變體為研究對(duì)象，對(duì)其突變體致病性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)決定致病性的關(guān)鍵位點(diǎn)，進(jìn)一步了解該病毒致病的分子機(jī)理。
　　病毒外殼蛋白不僅是病毒正常組裝所必須的，還參與了病毒的長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程。通過(guò)農(nóng)桿菌浸

2、潤(rùn)接種的方法，對(duì)CGMMV CP丙氨酸掃描文庫(kù)各個(gè)突變體在本生煙和西瓜上的致病性進(jìn)行了初步篩選，并通過(guò)DAS-ELISA和一步RT-PCR對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)。在接種本生煙后，所有的134個(gè)突變體中，有23個(gè)丙氨酸突變體在接種本生煙后癥狀發(fā)生改變，且突變前大部分為非極性氨基酸。還有49個(gè)突變體在接種后未顯癥，且病毒檢測(cè)為陰性。另外，癥狀改變的突變體在CP蛋白亞基上的定位有一定可循規(guī)律，23個(gè)突變位點(diǎn)全部定位于四個(gè)α螺旋內(nèi)側(cè)的中空結(jié)構(gòu)區(qū)域內(nèi)，且

3、在三級(jí)結(jié)構(gòu)上位于病毒外殼蛋白亞基外表面區(qū)域。
　　黃瓜綠斑駁花葉病毒的病毒起始裝配位點(diǎn)是位于病毒基因組RNA上，當(dāng)外殼蛋白聚合體與病毒基因組RNA相結(jié)合從而引導(dǎo)病毒起始裝配的核苷酸區(qū)域。在對(duì)病毒起始裝配位點(diǎn)及其附近區(qū)域盼突變體V94A、V97、T104A進(jìn)行致病性分析時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，這三個(gè)突變體接種后都能導(dǎo)致本生煙癥狀的明顯延遲，并且它們的外殼蛋白第96位氨基酸都有一個(gè)共同的替換型自發(fā)性突變，由谷氨酸替換突變?yōu)橘嚢彼?。在V94A、V

4、97、T104A的基礎(chǔ)上，人工插入E96-K突變構(gòu)建了雙位點(diǎn)突變體V94A-E96K、V97-E96K和T104A-E96K，并構(gòu)建了E96K和E96A。分別利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)接種和摩擦接種的方法接種了本生煙和西瓜。我們總結(jié)出外殼蛋白第96位氨基酸在CGMMV致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，也首次證明了病毒起始裝配位點(diǎn)及其鄰近區(qū)域能夠影響病毒致病性。
　　為了篩選癥狀致弱的CGMMV弱毒株，參考已有研究的弱毒株相關(guān)致弱位點(diǎn)，利用定點(diǎn)突變的方

5、法構(gòu)建了單位點(diǎn)突變體E480G、A1124V、N1157D、P1397S、K546R、V557T、V651A、S762L、G86S、S534F、P1362L，還有雙位點(diǎn)突變體和多位點(diǎn)突變體480-1124、546-557、86-534、480-1124-1157、546-557-651、86-534-1362、GVDS和RTAL。通過(guò)比對(duì)這些突變體的致病性，我們發(fā)現(xiàn)位于復(fù)制相關(guān)蛋白結(jié)構(gòu)域間隔區(qū)的氨基酸第480位點(diǎn)能夠引起癥狀的延遲，而當(dāng)