PRRSV GP5糖基化位點對VLPs形成的影響及免疫原性分析.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起豬的一種高度接觸性傳染病，以妊娠母豬繁殖障礙及新生仔豬的呼吸困難為主要特征。我國自2006年出現(xiàn)和流行的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒毒株(HR-PRRSV)更是給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。
　　病毒樣顆粒作為新型疫苗研發(fā)的平臺，其構(gòu)象更接近于天然病毒，具有良好

2、的抗體反應(yīng)性和免疫原性，且安全性更高。為了進一步提高PRRSV VLPs的免疫特性，本研究對PRRSV BB0907株GP5的糖基化位點進行了修飾，構(gòu)建了表達PRRSV VLPs的重組桿狀病毒，并對小鼠進行免疫原性分析。具體研究內(nèi)容如下:
　　1.PRRSV截短GP5蛋白多克隆抗體的制備及間接ELISA方法的建立
　　由于完整的GP5蛋白在原核表達系統(tǒng)中難以表達，所以本研究選擇GP5蛋白C端130-200位的氨基酸進行原核表

3、達，以純化的重組蛋白tGP5為免疫原，進行BALB/c小鼠免疫，制備多克隆抗血清。雖然血清能夠與重組蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，而且ELISA方法檢測也顯示獲得了高效價的多克隆抗體，但病毒中和試驗結(jié)果卻顯示該抗體沒有中和活性。
　　目前尚無有效的血清學檢測方法來評價豬群疫苗免疫或感染后抗體水平與免疫保護力之間的關(guān)系。為建立PRRSV GP5蛋白的ELISA方法，選擇純化的重組蛋白tGP5為包被抗原建立了檢測針對GP5蛋白抗體的ELISA方

4、法，優(yōu)化后反應(yīng)條件為:抗原包被濃度2μg/mL，37℃包被2h，5％脫脂乳37℃封閉2h，待檢血清稀釋度1∶100，37℃作用1h，二抗1∶20000稀釋，37℃作用45 min，37℃顯色3 min，抗體臨界值OD450nm≥0.22判為陽性，OD450nm＜0.183判為陰性，介于兩者之間為可疑。特異性和重復(fù)性試驗證明與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬口蹄疫病毒血清抗體無交叉反應(yīng)，批內(nèi)、批間重復(fù)性較好。用該方法檢測判定的

5、30份陰、陽性血清來做中和試驗，結(jié)果顯示中和試驗判定結(jié)果與該方法不一致，說明用E.cloi表達的130-200位的tGP5蛋白建立的間接ELISA方法不能代替中和試驗來評價豬群抗體水平與免疫保護力之間的關(guān)系。
　　2.GP5基因糖基化位點對VLPs形成的影響
　　為了研究GP5糖基化位點對VLPs形成的影響，本研究對PRRSV GP5的四個糖基化位點GN30S、GN35S、GN44S、GN51S分別進行了突變，同時在GP5基

6、因A表位和B表位之間插入一段含有27個堿基序列的HA標簽，以GP5基因原始序列為對照，設(shè)計了8對引物，利用重疊延伸PCR擴增目的基因片段，分別克隆至昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)的pFastBac Dual載體上，經(jīng)PCR、雙酶切和基因測序鑒定得到的重組質(zhì)粒，同時構(gòu)建共同表達M蛋白和N蛋白的重組質(zhì)粒。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入DH10Bac感受態(tài)細菌中，經(jīng)兩輪藍白斑篩選和菌液PCR鑒定得到重組Bacmid質(zhì)粒。最后在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將重組Bacmid

7、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Sf9細胞中，得到7種重組桿狀病毒。然后將6種GP5重組桿狀病毒分別與rBac-MN共同感染Sf9細胞，經(jīng)Western-blot鑒定后進行透射電鏡觀察，結(jié)果顯示6種GP5重組桿狀病毒在電鏡下均能觀察到VLPs，說明單個突變GP5糖基化位點不會影響PRRSV VLPs的組裝，A/B表位之間插入小段HA標簽也不會影響VLPs的形成。
　　3.桿狀病毒表達的PRRSV VLPs的免疫原性分析
　　為了探討上述構(gòu)建的6種

8、PRRSV VLPs免疫特性，本研究選擇48只BALB/c小鼠，分為8組，每組6只。設(shè)Sf9細胞裂解物為陰性對照、PRRSV疫苗為陽性對照，與上述得到的6種PRRSV VLPs同時免疫小鼠，經(jīng)三次免疫分析上述VLPs的免疫效果。每次免疫后檢測GP5蛋白ELISA抗體效價，二免、三免后均測定中和抗體的效價和細胞因子IL-4和IFN-γ含量的變化。結(jié)果為:首免三周后測定的ELISA抗體較低，二免、三免后抗體水平進一步提高，8組中rBac-G