E-鈣粘蛋白不同位點(diǎn)N-糖基化對(duì)鈣離子依賴細(xì)胞粘附及細(xì)胞周期進(jìn)程的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)是主要分布于上皮細(xì)胞表面的I型跨膜糖蛋白，它不僅參與形成細(xì)胞間粘附連接(adherens junctions，AJs)、維持細(xì)胞極性和組織完整性，更重要的是它將細(xì)胞外信息傳導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，介導(dǎo)細(xì)胞間的信息傳遞。E-鈣粘蛋白能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，大量文獻(xiàn)證實(shí)，許多惡性腫瘤的發(fā)生都伴有E-鈣粘蛋白表達(dá)降低或功能缺失，因此E-鈣粘蛋白被認(rèn)為是一種重要的腫瘤抑制分子。 E-鈣粘蛋白主要由胞外、

2、跨膜及胞內(nèi)肽段三部分組成。由人E-鈣粘蛋白氨基酸序列推測(Gene Bank Accession No．L08599)，E-鈣粘蛋白胞外肽段存在四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(N-X-S/T)，分別位于Asn 554、Asn 566、Asn 618及Asn 633(N554、N566、N618及N633)。雖然E-鈣粘蛋白在介導(dǎo)鈣離子依賴的細(xì)胞間粘附、抑制腫瘤發(fā)展方面具有重要的生物學(xué)功能，但是至今我們對(duì)其N-糖基化結(jié)構(gòu)及功能的了解并不深入。

3、 為了深入闡明E-鈣粘蛋白N-糖基化的結(jié)構(gòu)及功能，實(shí)驗(yàn)室前期，分別或聯(lián)合地將這四個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)的一致性序列(NXS/T)中的天冬酰胺突變?yōu)楣劝滨０罚瑯?gòu)建了一系列缺失E-鈣粘蛋白不同位點(diǎn)N-糖基化的突變E-鈣粘蛋白真核基因表達(dá)質(zhì)粒，并將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入本身不表達(dá)E-鈣粘蛋白的高侵襲性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435中，篩選后獲得八株穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。前期實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，N633位點(diǎn)的N-糖基化似乎對(duì)于E-鈣粘蛋白的穩(wěn)定表達(dá)至關(guān)重要，去除

4、這一位點(diǎn)的N-糖基化，E-鈣粘蛋白在蛋白水平不能夠表達(dá)。 如前所述，人E-鈣粘蛋白胞外肽段存在四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，由于糖蛋白并非每個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)都一定發(fā)生N-糖基化修飾， 本文的第一部分首先鑒定E-鈣粘蛋白四個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)是否存在N-糖基化，并應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)及糖苷酶酶切的方法初步了解N-糖鏈的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘蛋白四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)都存在N-糖基化修飾，而且這四個(gè)位點(diǎn)的N-糖鏈可能都是復(fù)雜型N

5、-糖鏈。 有文獻(xiàn)報(bào)道，N-糖基化的異常修飾可能影響鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附。高爾基體內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V(GnT-V)過表達(dá)，催化N-鈣粘蛋白使其β1-6分支的N-糖鏈結(jié)構(gòu)增加，N-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附能力明顯下降；而高爾基體內(nèi)另外一種與GnT-V有競爭性的糖基轉(zhuǎn)移酶N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅲ(GnT-Ⅲ)過表達(dá)，催化E-鈣粘蛋白使其平分型的N-乙酰氨基葡萄糖鏈結(jié)構(gòu)增加時(shí)，E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附能力增加。

6、這些研究結(jié)果提示，N-糖基化結(jié)構(gòu)的改變可能影響鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附，但N-糖基化如何影響E-鈣粘蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞粘附及其分子機(jī)制目前并沒有報(bào)道。 本文的第二部分系統(tǒng)研究這一問題。 應(yīng)用細(xì)胞聚集實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，E-鈣粘蛋白N554、N566兩個(gè)位點(diǎn)的N-糖基化顯著影響E-鈣粘蛋白的細(xì)胞粘附功能，去除這兩個(gè)位點(diǎn)N-糖基化細(xì)胞粘附能力顯著下降伴而遷移能力增加；而N618位點(diǎn)的N-糖基化似乎對(duì)于E-鈣粘蛋白的粘附功能及細(xì)胞的遷移能

7、力沒有顯著影響。在本文第三部分研究中，我們進(jìn)一步探討了N-糖基化影響E-鈣粘蛋白細(xì)胞粘附功能的分子機(jī)制。我們首先應(yīng)用放線菌酮初步分析N-糖基化對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響。 研究發(fā)現(xiàn)，與N633位點(diǎn)顯著影響蛋白穩(wěn)定性不同，N554、N566和N618位點(diǎn)的N-糖基化基本不影響蛋白穩(wěn)定表達(dá)。免疫熒光及Triton X-100抽提實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這三個(gè)位點(diǎn)的N-糖基化也并不影響E-鈣粘蛋白在細(xì)胞表面及細(xì)胞粘附連接處(adherens junctio

8、ns，AJs)的表達(dá)，這樣的結(jié)果說明，N-糖基化并非通過影響E-鈣粘蛋白穩(wěn)定性或E-鈣粘蛋白在細(xì)胞粘附連接處的表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞粘附。那么，N-糖基化如何影響E-鈣粘蛋白的粘附功能呢?我們隨后的研究發(fā)現(xiàn)，去除E-鈣粘蛋白N554，N566和N618位點(diǎn)的N-糖基化會(huì)引起β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高。而β-連環(huán)蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高往往會(huì)導(dǎo)致E-鈣粘蛋白/β-連環(huán)蛋白復(fù)合物解體。接下來，通過對(duì)細(xì)胞粘附連接復(fù)合物進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)，

9、去除E-鈣粘蛋白N554、N566和N618位點(diǎn)N-糖基化后細(xì)胞粘附連接處β-連環(huán)蛋白及a-連環(huán)蛋白含量明顯下降。因此我們得出結(jié)論，E-鈣粘蛋白N554、N566和N618位點(diǎn)的N-糖基化通過影響β-連環(huán)蛋白的酪氨酸磷酸化水平，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附連接復(fù)合物中β-，a-連環(huán)蛋白的含量，最終影響細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附能力。 作為重要腫瘤抑制分子，E-鈣粘蛋白能有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，影響腫瘤的惡性行為。那么N-糖基化是否參與E-鈣粘

10、蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響?在本文第四部分的研究中，我們探討了E-鈣粘蛋白N-糖基化對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在MDA-MB-435細(xì)胞中，野生型E-鈣粘蛋白能夠抑制周期蛋白cyclin Dl的表達(dá)，抑制細(xì)胞由Gl向S期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)Gl期阻滯；然而，隨后的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)N554、N566及N618位點(diǎn)N-糖基化對(duì)于E-鈣粘蛋白對(duì)細(xì)胞Gl/S轉(zhuǎn)化的抑制效應(yīng)是十分關(guān)鍵的，一旦去除這三個(gè)位點(diǎn)N-糖基化，突變E-鈣粘蛋白似乎不能夠抑制

11、MDA—MB-435細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)E-鈣粘蛋白這三個(gè)位點(diǎn)的N-糖基化通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號(hào)通路影響了MDA-MB-435細(xì)胞Gl/S期的轉(zhuǎn)化。值得注意的是，N554、566兩個(gè)位點(diǎn)的N-糖基化，尤其前者，顯著影響E-鈣粘蛋白對(duì)Gl/S轉(zhuǎn)化的抑制。本論文研究發(fā)現(xiàn)，不同位點(diǎn)N-糖基化對(duì)E-鈣粘蛋白穩(wěn)定性及生物學(xué)功能的影響不