HCMV感染對宿主細胞周期進程影響機制及中藥干預(yù)分子機制的研究.pdf

1、第一部分HCMV感染對細胞周期進程和Cyclins表達的影響 目的：觀察HCMV感染對宿主細胞DNA合成及Cyclins表達的影響。 方法：用HCMVAD169毒株感染人胚肺成纖維細胞(HEL)，測定病毒感染性滴度及建立感染性模型。通過接觸抑制使細胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分別于感染后0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h、96h終止培養(yǎng)。用流式細胞術(shù)測定HCM

2、V感染后細胞周期進程及DNA含量。用WesternBlot法檢測CyclinE、CyclinA、CyclinD1蛋白的表達。 結(jié)果：HCMV感染細胞后24h～96h，S期細胞明顯增多，G2/M期細胞減少，至感染后96h，未發(fā)現(xiàn)有G2/M期細胞。感染后24h細胞保持2NDNA含量，全部感染細胞DNA含量在48h內(nèi)開始升高，感染后72h多數(shù)細胞的DNA含量大于2NDNA含量，但未發(fā)現(xiàn)有4NDNA含量的細胞。在正常對照細胞DNA含量沒

3、有增加。HCMV+PAA組沒有檢測到DNA含量增加。HCMV感染接觸抑制細胞12h時CyclinE蛋白被誘導(dǎo)，感染后24h出現(xiàn)CyclinE峰值；HCMV不能誘導(dǎo)CyclinA蛋白表達；CyclinD1沒有被誘導(dǎo)，且在感染后24h開始下降。 結(jié)論：HCMV感染同步化于G0/G1期的細胞后，誘導(dǎo)CyclinE蛋白明顯升高，激活CyclinE/Cdk2激酶，使細胞周期越過G1/S限制點，將細胞周期阻止于晚G1期。病毒感染未能激活細胞

4、DNA合成，病毒感染后總DNA的增加由病毒DNA復(fù)制造成。 第二部分HCMV感染對宿主細胞Cdk2的影響 目的：觀察HCMV感染細胞Cdk2的亞細胞定位，研究HCMV感染對Cdk2蛋白水平及對CyclinE/Cdk2激酶活性的影響。 方法：通過接觸抑制使細胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percellHCMVAD169毒株感染人胚肺成纖維細胞(HEL)，用免疫細胞化學(xué)技術(shù)分別測定HCMV感染

5、前及感染后24hCdk2亞細胞定位；Westernblot法測定HCMVCdk2蛋白豐度；用免疫沉淀，激酶活性分析法檢測HCMV感染細胞內(nèi)Cdk2的活性。 結(jié)果：接觸抑制阻止在G0期細胞Cdk2游離在細胞質(zhì)，HCMV感染24小時內(nèi)導(dǎo)致Cdk2從細胞漿移位到細胞核。同時HCMV感染可引起cyclinE/Cdk2激酶的強烈激活，但HCMV感染并不誘導(dǎo)Cdk2蛋白豐度增加。 結(jié)論：HCMV感染G0/G1細胞，在24h內(nèi)導(dǎo)致Cd

6、k2從細胞漿移位到細胞核。使之與細胞核內(nèi)的調(diào)節(jié)亞單位CyclinE結(jié)合，激活CyclinE/Cdk2激酶。使細胞周期越過G1/S限制點，進展至晚G1期。 第三部分中藥金葉敗毒制劑對HCMV感染細胞cip1、kip1基因轉(zhuǎn)錄和表達的影響 目的:研究中藥金葉敗毒制劑對HCMV感染細胞的周期調(diào)控抑制基因cip1、kip1蛋白表達及cip1mRNA水平的影響，探討中藥金葉敗毒制劑體外對HCMV感染的阻斷效應(yīng)及其機制。

7、 方法:通過接觸抑制使細胞同步化于G0/G1期，用MOI=5PFU/percell的病毒感染HEL，分別于感染后0h、24h、48h、72h、96h終止培養(yǎng)。采用RT-PCR法及Westernbiot法，分別檢測HCMV感染后0h、24h、48h、72h、96h細胞中cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白豐度，檢測中藥金葉敗毒制劑干預(yù)后cip1mRNA水平及cip1、kip1蛋白豐度的變化。 結(jié)果:病毒感染后0h、2