病毒吸附對(duì)宿主細(xì)胞膜的影響及中藥的干預(yù)作用.pdf

1、病毒性疾病的危害已威脅到人類(lèi)生存，在2006年3月由國(guó)際醫(yī)學(xué)科學(xué)院組織召開(kāi)的第二屆全球大會(huì)上，500名專(zhuān)家指出：不斷變化的病毒使全球處于大流行的危險(xiǎn)之中。WHO等單位聯(lián)合發(fā)布的《發(fā)展中國(guó)家疾病控制優(yōu)先項(xiàng)目》中指出：人類(lèi)衛(wèi)生面臨的四大挑戰(zhàn)，其中第三項(xiàng)為新發(fā)病毒性疾病的大流行。 隨著分子生物學(xué)理論和技術(shù)在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用，盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)病毒感染機(jī)制的認(rèn)識(shí)有了飛越性的發(fā)展，但控制手段始終沒(méi)有突破性進(jìn)展，尋找有效的控制病毒性疾病的手段

2、已成為21世紀(jì)人類(lèi)的重要事件。 中醫(yī)藥防治病毒性疾病有數(shù)千年的經(jīng)驗(yàn)和完整的理論體系，是中醫(yī)藥治病的優(yōu)勢(shì)領(lǐng)域。以其療效確切、相對(duì)廣譜、低毒的特點(diǎn)已被世人所接受，醫(yī)學(xué)界期待從中醫(yī)藥中發(fā)現(xiàn)控制病毒性疾病的有效藥物。近20年來(lái)，雖然大量的試驗(yàn)證實(shí)了中藥治療病毒性疾病的有效，尤其是SARS以后國(guó)內(nèi)外從中藥中尋找有效的抗病毒成分成為熱點(diǎn)，但直至目前抗病毒中藥的研制并沒(méi)有突破性進(jìn)展。其原因①缺乏充分體現(xiàn)中醫(yī)藥治療病毒性疾病特點(diǎn)的研究思路；②缺

3、乏充分體現(xiàn)中醫(yī)藥治療病毒性疾病特點(diǎn)的研究手段。因此，在中醫(yī)藥治療病毒性疾病理論的指導(dǎo)下，應(yīng)用現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)和手段研究中藥治療病毒性疾病的機(jī)理，對(duì)中藥走向世界具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究在原有抗病毒藥效試驗(yàn)和抗病毒作用機(jī)理研究的基礎(chǔ)上，從病毒吸附環(huán)節(jié)的一些非特異性病理生理環(huán)節(jié)入手，以2～3種病毒株為樣本，進(jìn)一步探討病毒吸附細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制和中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對(duì)此環(huán)節(jié)的干預(yù)作用，為尋找中藥抗病毒作用的真正靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

4、本論文的研究?jī)?nèi)容為國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助課題的部分內(nèi)容。 一、梔子提取物ZG及半枝蓮總黃酮的體外抗病毒作用研究以Hep-2細(xì)胞株作為宿主細(xì)胞，以阿昔洛韋作為抗單純皰疹病毒1型的陽(yáng)性對(duì)照藥，采用致細(xì)胞病變法(cytopathiceffectCPE)來(lái)觀察梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對(duì)4種病毒致細(xì)胞病變作用的影響，并按Reed-Muench方法計(jì)算最大無(wú)毒濃度(TC0)，50﹪細(xì)胞毒性濃度(TC50)，50﹪抑制濃度(IC50

5、)和治療指數(shù)(TI)。結(jié)果顯示：梔子提取物ZG對(duì)Hep-2細(xì)胞的TC0和TC50分別為5mg·mL-1和12.74mg·mL-1；半枝蓮總黃酮對(duì)Hep-2細(xì)胞的TC0和TC50分別為3.13mg·mL-1和8.91mg·mL-1；阿昔洛韋的TC0和TC50分別為0.2mg·mL-1和1.14mg·mL-1。梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮均對(duì)單純皰疹病毒1型(HSV-1)和副流感病毒1型(PIV-1)所引起的細(xì)胞病變有明顯抑制作用，半枝蓮總

6、黃酮對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)有明顯的抑制作用；兩者對(duì)柯薩奇B族病毒4型(CoxB4)均無(wú)明顯抑制作用。其中，梔子提取物ZG對(duì)HSV-1的IC50為0.45mg·mL-1，TI為28.31；對(duì)PIV-1的IC50為1.00mg·mL-1，TI為12.68。半枝蓮總黃酮對(duì)HSV-1的IC50為1.28mg·mL-1，TI為6.96；對(duì)PIV-1的IC50為1.41mg·mL-1，TI為6.32；對(duì)RSV的IC50為0.68mg·mL-1，

7、TI為13.10。陽(yáng)性對(duì)照藥阿昔洛韋對(duì)PIV-1的IC50和TI分別為0.05mg·mL-1和19.05。 二、病毒吸附對(duì)宿主細(xì)胞膜電位的變化及中藥的干預(yù)作用運(yùn)用細(xì)胞膜電位特異性熒光探針DiBAC4(3)標(biāo)記Hep-2細(xì)胞膜電位，以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段，觀察3種不同病毒(HSV-1，PIV-1，Ad-3)吸附過(guò)程中宿主細(xì)胞膜電位的變化情況；并以氯化乙酰膽堿為陽(yáng)性對(duì)照，探討中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對(duì)此過(guò)程的干預(yù)作用，為研究

8、病毒吸附宿主細(xì)胞的生物學(xué)機(jī)制及中藥對(duì)此環(huán)節(jié)的干預(yù)作用提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示：正常Hep-2細(xì)胞膜電位熒光值在靜息狀態(tài)下基本穩(wěn)定在65-75范圍內(nèi)；2種中藥對(duì)正常細(xì)胞膜電位基本無(wú)影響；HSV-1和PIV-1病毒吸附30min內(nèi)，膜電位下降，處于超級(jí)化狀態(tài)；2種中藥均分別以3種加藥方式作用后，對(duì)HSV-1和PIV-1吸附過(guò)程中Hep-2細(xì)胞膜電位的超極化狀態(tài)均沒(méi)有明顯影響。結(jié)論：病毒吸附宿主細(xì)胞過(guò)程中使膜電位持續(xù)下降，處于超極化狀態(tài)，從而有

9、利于病毒的內(nèi)化，可能為病毒感染的生物學(xué)機(jī)制之一。乙酰膽堿對(duì)病毒吸附過(guò)程中膜電位的下降有明顯改善的作用，而梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮對(duì)此無(wú)明顯干預(yù)作用，說(shuō)明中藥抗病毒機(jī)理可能與此環(huán)節(jié)無(wú)關(guān)。 三、病毒吸附對(duì)宿主細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性的影響及中藥的干預(yù)作用采用定磷法和分光光度計(jì)檢測(cè)HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶活性的變化，以探討病毒吸附環(huán)節(jié)的生物學(xué)機(jī)制。同時(shí)設(shè)肝素鈉為陽(yáng)性對(duì)照藥，觀察中

10、藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在三種不同加藥方式作用后，對(duì)HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性變化的干預(yù)作用。結(jié)果顯示：HSV-1和PIV-1在吸附Hep-2細(xì)胞過(guò)程中，細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性均顯著增加，與正常細(xì)胞組比較有顯著性差異；梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在3種加藥方式作用下，對(duì)HSV-1和PIV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有顯著的升高趨勢(shì)，但與病毒對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異；肝素鈉在3種加藥方

11、式作用下，對(duì)HSV-1吸附后Na+-K+-ATP酶活性均有降低的趨勢(shì)，其中以先加藥后病毒吸附組最為顯著，但與病毒對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異。結(jié)論：在HSV-1和PIV-1內(nèi)化過(guò)程中，膜Na+-K+-ATP酶活性升高，說(shuō)明在HSV-1和PIV-1感染細(xì)胞的過(guò)程中確實(shí)有能量的參與，病毒借助ATP水解產(chǎn)生的能量感染宿主細(xì)胞，但其具體的生物學(xué)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。中藥梔子提取物ZG和半枝蓮總黃酮在其有效劑量?jī)?nèi)，3種加藥方式下，均有升高病毒吸附后宿主

12、細(xì)胞膜Na+-K+-ATP酶活性的趨勢(shì)，由于國(guó)內(nèi)外目前未見(jiàn)該方面的研究和報(bào)道，中藥對(duì)此環(huán)節(jié)可能的作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。肝素鈉具有封閉HSV-1配體的作用，可通過(guò)阻斷HSV-1吸附來(lái)間接干預(yù)Na+-K+-ATP酶活性的升高；但與HSV-1對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差異提示與病毒量比較肝素鈉用量可能相對(duì)不足。 四、病毒吸附對(duì)宿主細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響及中藥的干預(yù)作用以往研究發(fā)現(xiàn)正常細(xì)胞膜具有良好的流動(dòng)性，漂白后熒光恢復(fù)率為73.89﹪；HS

13、V-1感染后Hep-2細(xì)胞膜流動(dòng)性顯著降低，熒光恢復(fù)率為18.54﹪；梔子提取物ZG3種用藥方式作用下，均可明顯改善HSV-1感染細(xì)胞膜的流動(dòng)性。本研究中除進(jìn)一步驗(yàn)證梔子提取物ZG對(duì)HSV-1吸附后Hep-2細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響外，同時(shí)又觀察PIV-1吸附后細(xì)胞膜流動(dòng)性的變化及半枝蓮總黃酮對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性的影響。結(jié)果顯示：正常細(xì)胞膜具有良好的流動(dòng)性，熒光恢復(fù)率為72.66﹪；HSV-1和PIV-1吸附后Hep-2細(xì)胞膜流動(dòng)性均顯著降低，熒光

14、恢復(fù)率分別為為26.73﹪和19.85﹪；梔子提取物ZG在3種不同用藥方式作用下，均可明顯改善HSV-1和PIV-1吸附后細(xì)胞膜的流動(dòng)性，與病毒感染對(duì)照組比較均有顯著性差別；在半枝蓮總黃酮3種用藥方式中，對(duì)HSV-1感染的影響，其中先用藥處理后病毒吸附組和藥物處理同時(shí)病毒吸附兩組可明顯改善細(xì)胞膜流動(dòng)性，擴(kuò)散系數(shù)和熒光恢復(fù)率均顯著升高，并與病毒對(duì)照組比較有顯著性差異；而先病毒吸附后藥物作用組以及對(duì)PIV-1的3個(gè)不同用藥組對(duì)細(xì)胞膜流動(dòng)性均