人循環(huán)纖維細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定及中藥藥理血清的干預(yù)作用.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)以往對(duì)中醫(yī)藥抗多器官纖維化研究的積累，通過(guò)對(duì)中醫(yī)“異病同治”理論內(nèi)涵的深入思考，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究成果，提出了中醫(yī)藥干預(yù)多器官纖維化作用于“骨髓一血液一靶器官”軸的假設(shè)。已有研究發(fā)現(xiàn)成人外周血中存在一種與多器官纖維化疾病相關(guān)的白細(xì)胞亞群——循環(huán)纖維細(xì)胞具有分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能，來(lái)源于骨髓，存在于外周血，是一種過(guò)渡型細(xì)胞，能夠隨血液遷移到損傷組織中，進(jìn)一步分化、成熟為成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞。 [目的] 從成人外周血中分

2、離、純化循環(huán)纖維細(xì)胞，建立起穩(wěn)定、可靠的培養(yǎng)手段和鑒定方法，了解體外培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能，建立起循環(huán)纖維細(xì)胞體外分化、生成細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞模型，并在以往研究復(fù)方鱉甲軟肝方防治多器官纖維化的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討方中的兩個(gè)組成藥物：黃芪和莪術(shù)的藥理血清對(duì)循環(huán)纖維細(xì)胞的干預(yù)作用。 [方法] 實(shí)驗(yàn)采用Ficoll梯度密度離心的方法分離成人外周血，獲得“白衣”層單個(gè)核細(xì)胞后，研究了接種密度、共培養(yǎng)時(shí)間、血清濃度等因素對(duì)循環(huán)纖

3、維細(xì)胞培養(yǎng)、分化的影響。結(jié)合流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光染色和細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)，對(duì)體外培養(yǎng)的人循環(huán)纖維細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，并與人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、人胚肺成纖維細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行了比較，同時(shí)通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察，進(jìn)一步對(duì)循環(huán)纖維細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了鑒定。通過(guò)天狼星紅染色、羥脯氨酸含量測(cè)定和Western blotting比較了不同培養(yǎng)時(shí)期的人循環(huán)纖維細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征和功能。在對(duì)人循環(huán)纖維細(xì)胞體外進(jìn)行培養(yǎng)、分化研究的基

4、礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了復(fù)方鱉甲軟肝方中的兩個(gè)藥物：黃芪和莪術(shù)的藥理血清對(duì)循環(huán)纖維細(xì)胞增殖和膠原合成能力的影響。 [結(jié)果] 1 循環(huán)纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的特征體外培養(yǎng)的單個(gè)核細(xì)胞，1d后有細(xì)胞貼壁，細(xì)胞圓形、幼?。蝗コ龖腋〉牧馨图?xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，這些貼壁的細(xì)胞在第3d即開(kāi)始分化，出現(xiàn)大量成束幼小的長(zhǎng)梭形細(xì)胞；7d后細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)變大，基本呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣形態(tài)；而到第15d細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始分化成熟，個(gè)體進(jìn)一步生長(zhǎng)，呈長(zhǎng)梭形、紡錘形等，其大

5、小和形態(tài)基本接近典型的成纖維細(xì)胞，細(xì)胞開(kāi)始變得鋪展、扁平而透明。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，這些貼壁細(xì)胞到第9d即有83．5％細(xì)胞表達(dá)COLI蛋白。 2 循環(huán)纖維細(xì)胞體外的培養(yǎng)影響因素高密度接種雖然有利于細(xì)胞貼壁，并能加速細(xì)胞的分化節(jié)奏，但同時(shí)也黏附了大量淋巴細(xì)胞，長(zhǎng)期與大量淋巴細(xì)胞共存，對(duì)于貼壁細(xì)胞的分化是不利的，最終將中斷其向成纖維細(xì)胞方向的分化，因此細(xì)胞貼壁后1d及時(shí)去除非貼壁細(xì)胞對(duì)于循環(huán)纖維細(xì)胞的非常關(guān)鍵。接種量為0.75×10<

6、'6>PBMCs/cm<'2>時(shí)，既能給所有細(xì)胞相互接觸作用的機(jī)會(huì)，同時(shí)也可以通過(guò)細(xì)胞代謝迅速降低培養(yǎng)液的pH，這種條件下會(huì)明顯促進(jìn)貼壁細(xì)胞向長(zhǎng)梭形的成纖維細(xì)胞樣方向分化。循環(huán)纖維細(xì)胞在含10％和20％血清的DMEM培養(yǎng)液中均能生長(zhǎng)，前者的分化速度較慢。 3 循環(huán)纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)掃描電鏡下細(xì)胞間相互接觸，呈明顯的長(zhǎng)梭形，核區(qū)微隆起，細(xì)胞有少數(shù)較粗的突起及纖細(xì)的絲狀偽足。透射電鏡顯示細(xì)胞內(nèi)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富、擴(kuò)張；胞漿中有豐富的游

7、離核糖體；高爾基體發(fā)達(dá)，在其成熟面可見(jiàn)大小不一的分泌囊泡；線粒體較多，體大而圓；細(xì)胞核較小，不規(guī)則，胞質(zhì)豐富。循環(huán)纖維細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞的典型形態(tài)學(xué)特征。 4 免疫熒光鑒定早期培養(yǎng)的循環(huán)纖維細(xì)胞表達(dá)干/祖細(xì)胞表面標(biāo)記CD34和白細(xì)胞共同表面抗原CD45，伴隨著循環(huán)纖維細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中分化、成熟，這兩個(gè)表面標(biāo)記逐漸消失，COL Ⅰ、COLⅢ表達(dá)增強(qiáng)。體外培養(yǎng)30d后終末分化的循環(huán)纖維細(xì)胞表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α—SMA，循環(huán)纖

8、維細(xì)胞不表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vwF。 5 循環(huán)纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的能力Western blotting檢測(cè)了處于不同分化階段的循環(huán)纖維細(xì)胞和人胚肺成纖維細(xì)胞分泌膠原的種類，結(jié)果表明這些細(xì)胞均表達(dá)Ⅰ型和Ⅲ型膠原。和人胚肺成纖維細(xì)胞相比，循環(huán)細(xì)胞培養(yǎng)液中膠原含量較低，而細(xì)胞層中沉積膠原的含量明顯高于人胚肺成纖維細(xì)胞。 6 中藥藥理血清對(duì)循環(huán)纖維細(xì)胞的干預(yù)作用初步建立了循環(huán)纖維細(xì)胞體外分化、增殖和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞模型

9、，探索了藥理血清干預(yù)循環(huán)纖維細(xì)胞增殖和膠原合成兩個(gè)環(huán)節(jié)的實(shí)驗(yàn)條件。通過(guò)藥理血清干預(yù)細(xì)胞模型的研究，證明黃芪能夠抑制膠原分泌減少培養(yǎng)液中羥脯氨酸的含量，莪術(shù)能抑制循環(huán)纖維細(xì)胞增殖。兩藥疊加對(duì)上述兩個(gè)環(huán)節(jié)沒(méi)有顯著作用。 [結(jié)論] 建立了穩(wěn)定、可靠的分離、培養(yǎng)人循環(huán)纖維細(xì)胞的方法。通過(guò)與人胚肺成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的比較，證明了成人外周血中確實(shí)存在一種前體細(xì)胞——循環(huán)纖維細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)，能夠分化為成纖維細(xì)胞。初步掌