枯草芽孢桿菌發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的研究.pdf

1、唾液酸(sialic acid,SA)，學(xué)名N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acytl-neuraminic Acid,簡稱NeuAc或Neu5Ac），是一類含有9個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的總稱，是天然存在的碳水化合物，并于上世紀50年代首次得到分離純化同時進行了結(jié)構(gòu)的確定。Neu5Ac在生命代謝活動調(diào)節(jié)的過程中起著重要作用，它廣泛地分布于多種生物組織中，通常位于非還原性寡聚糖的末端。Neu5Ac具有包括抗老年癡呆、抗識別、提高腸道對

2、維生素和礦物質(zhì)的吸收以及提高嬰兒的智力和記憶力，抗菌排毒和抗病毒等生理功能，目前已經(jīng)在多個領(lǐng)域得到了應(yīng)用。
　　枯草桿菌由于其GRAs（Generally Recognized as Safe）特性，在食品工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域受到了廣泛重視與應(yīng)用。本課題相關(guān)人員嘗試將重組質(zhì)粒pHT01-neuBC轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌B.subtilis168中并進行誘導(dǎo)表達，來構(gòu)建一條發(fā)酵生產(chǎn)Neu5Ac的代謝通路，并取得了初步成功。但是在基因工程菌B.s

3、ubtilis168/pHT01-neuBC發(fā)酵生產(chǎn)Neu5Ac過程中發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌在發(fā)酵中后期容易形成休眠體——芽孢，并且該外源重組質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)不能穩(wěn)定遺傳，高達72％的質(zhì)粒會隨著發(fā)酵過程中宿主細胞的生長分裂而丟失。據(jù)此推測以上兩個原因是限制枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)Neu5Ac性能的主要原因。
　　因此本論文所述課題主要涵蓋了以下三部分的內(nèi)容：第一，對枯草桿菌B.subtilis168進行芽孢敲除。發(fā)酵過程中芽孢休眠體的形成

4、是影響枯草桿菌外源基因表達水平的直接因素。選定芽孢形成相關(guān)基因spo0A基因作為敲除對象，利用同源重組法對spo0A基因進行了無痕敲除，得到了無芽孢的枯草桿菌突變株B.subtilis168Δspo0A。第二，架構(gòu)一條枯草桿菌從常見碳源到Neu5Ac的代謝通路。利用同源重組整合法,將N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB和N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶基因neuC整合到枯草桿菌B.sububtilis168基因組上，首次獲得了能夠穩(wěn)定表達外

5、源基因neuBC并能夠發(fā)酵生產(chǎn)Neu5Ac的工程菌B.subtilis168Δspo0A-neuBC。第三，通過對構(gòu)建的工程菌株進行了培養(yǎng)基組分包括碳源、氮源的優(yōu)化，進一步提高了N-乙酰神經(jīng)氨酸的發(fā)酵產(chǎn)量，篩選了最佳發(fā)酵條件，明顯提高了Neu5Ac的發(fā)酵產(chǎn)量。
　　對B.subtilis168進行芽孢敲除獲得了枯草芽孢桿菌基因工程菌B.subtilis168Δspo0A，經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)及菌種OD600檢測驗證后發(fā)現(xiàn)無芽孢枯草桿菌比野

6、生型菌株生長狀況更好。野生型枯草桿菌B.subtilis168不具備生產(chǎn)Neu5Ac的能力。經(jīng)過Neu5Ac代謝途徑構(gòu)建之后，對工程菌B.subtilis168Δspo0A-neuBC進行搖瓶發(fā)酵，成功得到了最大產(chǎn)量為0.397g·L-1的Neu5Ac，5L(裝液量2L，37℃)發(fā)酵罐放大生產(chǎn)獲得的最高產(chǎn)量為3.67g·L-1。通過對發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化獲得了最佳發(fā)酵方案：酵母粉16g·L-1，山梨醇20g·L-1,硫酸銨4g·L-1,

7、磷酸二氫鉀5g·L-1,七水硫酸鎂1g·L-1，維生素B0.4g·L-1，微量元素0.4g·L-1，在OD600=0.6時加入IPTG0.2mmol·L-1，發(fā)酵初始pH為自然pH。經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化使Neu5Ac的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量達到了0.46g·L-1。用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行5 L(裝液量2L，37℃)發(fā)酵罐上罐發(fā)酵，72h后得到的發(fā)酵液中Neu5Ac的最大產(chǎn)量為6.37g·L-1。
　　本研究開創(chuàng)了利用枯草芽孢桿菌對生產(chǎn)Neu5Ac所需