枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕生產(chǎn)大豆活性多肽的研究.pdf

1、大豆多肽是大豆蛋白經(jīng)酸、堿或酶的水解作用后得到的由不同氨基酸組成的多肽鏈的通稱，目前一般是指平均肽鏈長度為3～10個氨基酸殘基，主要分子量范圍為300～3000Da的低分子量短鏈肽。由于它們不僅具有良好的加工特性，還具有多種對人體有益的生理功能，因此它們也常被叫做大豆活性肽或大豆功能多肽等，并被視為一種很有前途的功能性食品而備受科研人員的關(guān)注。 目前我國對大豆多肽的生產(chǎn)研究雖然很多，但尚未形成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。其原因有兩個：一在

2、于生產(chǎn)成本居高不下；二蛋白酶解液往往產(chǎn)生苦味，嚴(yán)重影響了多肽制品的口味。 為克服目前我國在大豆活性肽研究和產(chǎn)業(yè)化中的不足，本課題建立一套生物技術(shù)生產(chǎn)大豆活性肽的工藝。主要是通過微生物發(fā)酵法產(chǎn)酶水解豆粕中的大豆蛋白，以獲得具有生理活性的大豆多肽；并通過數(shù)理優(yōu)化，確立了合適的發(fā)酵工藝：同時研究了膜技術(shù)在活性肽分離純化上的應(yīng)用；對發(fā)酵菌株的產(chǎn)酶特性及脫苦原理進行了探討；研究了發(fā)酵所得大豆多肽的生物活性和加工特性，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出一種

3、具有抗疲勞效果的大豆多肽功能性飲料。主要研究結(jié)果如下： 1、在參照常規(guī)酶水解蛋白工藝中蛋白水解度的測定方法基礎(chǔ)上建立了一種適于微生物發(fā)酵水解蛋白工藝的水解度測定方法。本方法通過測定肽鍵的斷裂數(shù)來反映蛋白被水解的程度，從原理上符合肽鍵被水解的規(guī)律，計算公式上反映了水解度的定義。操作簡單，快速，重復(fù)性好。 2、研究了菌株Bacillus．subtilis SHZ在發(fā)酵豆粕過程中代謝產(chǎn)酶水解大豆蛋白的動態(tài)。結(jié)果表明該菌株能產(chǎn)蛋

4、白酶和羧肽酶，在發(fā)酵的0～8 h，菌體主要分泌蛋白酶，將豆粕中的大豆蛋白初步水解成長鏈肽，發(fā)酵液略有苦味；隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行(8～16h)，蛋白酶將長鏈肽進一步水解成段中短鏈肽，同時在外肽酶的作用下，肽鏈內(nèi)部的疏水性氨基酸大量暴露，使得發(fā)酵液苦味激增；發(fā)酵中后期(24～32h)，菌體開始大量分泌羧肽酶，其能從肽鏈的羧基末端將疏水性的氨基酸切除從而脫苦；至發(fā)酵后期(40～48h)，發(fā)酵液中主要為非苦味的短鏈肽和游離氨基酸?？刂瓢l(fā)酵時間為3

5、6h，可以得到36h水解度為25％，分子量分布為300～1000Da的短肽鏈。 3、通過對比用堿性蛋白酶水解大豆蛋白所得到酶解物和用B.subtili SHZ發(fā)酵豆粕制備所得大豆多肽之間的苦味值和氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)具有顯著苦味的蛋白酶解液的氨基酸37.69％為疏水性氨基酸；而豆粕水解液中，疏水性氨基酸僅占總量的11.75％。利用B.subtili SHZ來發(fā)酵具有顯著苦味的蛋白酶解液，發(fā)酵到20h，蛋白酶解液的苦味值由4降到0，苦

6、味完全脫除，．證實了發(fā)酵菌株具有脫苦作用并推斷其中存在具有脫苦作用的肽酶產(chǎn)生體系。對B. subtili $HZ產(chǎn)肽酶特性進行進一步研究，發(fā)現(xiàn)其能在生長代謝過程中產(chǎn)生胞外的羧胰靜。對此羧肽酶進行初步分離純化，經(jīng)硫酸銨沉淀、乙醇分級沉淀和凝膠層析后，羧肽酶比活力由4.5提高到24.5，但酶蛋白和總酶活損失較大，回收率只有12.7％。將純化后得到的且subtili SHZ羧肽酶直接作用于苦味的蛋白酶解物上進行酶解：其能從苦昧肽的羧基末端將苯

7、丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、異亮氨酸等疏水性氨基酸切除，以游離態(tài)釋放出來，從而生成不苦的酶解物，這就是B．subtili SHZ脫苦的機理。 4、為獲得最高大豆多肽產(chǎn)量，采用響應(yīng)曲面法對B．subtiIi SHZ發(fā)酵豆粕產(chǎn)大豆多肽的培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。首先采用Box-Behnken實驗設(shè)計對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，最終獲得大豆多肽產(chǎn)量最高的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為，豆粕(氮源)52～58g/L，葡萄糖(碳源)7～9g/1，KH<,2>

8、PO<,4>(無機鹽)3g/l。以此發(fā)酵培養(yǎng)基可以獲得約為8m咖L的大豆多肽，比優(yōu)化前的平均6mg/mL提高了33％。接著在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用CCD實驗設(shè)計對發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，最終獲得大豆多肽產(chǎn)量最高的發(fā)酵條件為，發(fā)酵時間36h，溫度37℃，發(fā)酵液初始pH 7，搖床轉(zhuǎn)速140～160rpm。以此發(fā)酵條件可以獲得約為14mg/mL的大豆多肽，’比上述的8mg/mL又提高了65％。按照此最優(yōu)工藝發(fā)酵生產(chǎn)大豆多肽，豆粕中的大豆蛋白轉(zhuǎn)化

9、為大豆多肽的轉(zhuǎn)化率高達60％，是常規(guī)酶解法的3倍。 5、研究了超濾對發(fā)酵液的純化效果，結(jié)果表明在發(fā)酵液中，僅有0.85％的肽分子質(zhì)量大于30KDa；有2.42％的肽分子質(zhì)量在30～10KDa之間：而5～3KDa之間和小于5KDa的多肽分別占了總肽量20.4％和63.4％。同時生物活性測定表明，高分子量(>10KDa)的多肽液自由基清除能力較低，而

10、·自由基和-OH自由基清除率分別高達49％和82％，比同濃度的天然抗氧化劑生育酚的自由基清除力還強。對超濾各參數(shù)的研究表明，選用料液濃度50mg/mL，料液溫度30℃，操作壓力0.08MPa能獲得最佳膜通量和分離效果。隨著截留分子量的不斷降低，超濾液中肽的分子量在不斷下降，純度在逐步提高。經(jīng)RP-HPLC驗證，凝膠層析后所得具有最高生物活性的片段為單一多肽組分。 6、對發(fā)酵法制備的大豆多肽生物活性研究表明，其具有顯著的自由基清除

11、能力和體外抗氧化活性，活性隨著純化步驟的進行而不斷提高，其中O<,2><'->清除能力從最初的49％提高到62％，.OH清除能力從78％提高到90％，相對抗氧化值從2.0提高到2.8，具有最強體外抗氧化能力的是分子量約為1，300Da的短鏈肽。其抗氧化能力是相同濃度生育酚的1.5倍。體內(nèi)抗氧化實驗表明，小鼠經(jīng)灌胃大豆肽后，其血液中GSH-PX活力和SOD活力都得到了提高，MDA含量均低于標(biāo)準(zhǔn)飼料對照組，存在顯著性差異(P<0.01)，表

12、明大豆肽的體內(nèi)抗氧化機理與其能提高生物體內(nèi)的抗氧化酶活性有關(guān)。而灌胃中高劑量的大豆肽，降低MDA的效果比天然抗氧化劑生育酚(VE)的效果還明顯(P<0.01)。對大豆多肽的體內(nèi)抗疲勞實驗表明，三個劑量組小鼠游泳時間均比對照組延長，大豆多肽中高劑量組能顯著提高小鼠的肝糖原含量(p<0.05)，三個劑量組的小鼠在劇烈游泳后其血乳酸升高比值顯著低于對照組，說明小鼠運動時疲勞增加延緩；而血乳酸清除比值均顯著高于對照組(p<0.01)，說明其運動

13、后疲勞消除加快。根據(jù)衛(wèi)生部公布的保健食品評價指標(biāo)，可判斷發(fā)酵法制備所得大豆多肽具有抗疲勞的功能。 7、對發(fā)酵法制備的大豆多肽加工特性研究表明，其具有良好的溶解性，能在廣泛的pH范圍內(nèi)保持較高的氮溶指數(shù)(NSI>80％)。與大豆分離蛋白相比，具有良好的凝膠性，同時親水性大為增加。與大豆蛋白相比，大豆多肽具有良好的乳化性能，并在廣泛的pH范圍內(nèi)(pH2～8)均表現(xiàn)出最好的乳化性和乳化穩(wěn)定性。同時具有更多短鏈肽的發(fā)酵大豆多肽其起泡性和

14、泡沫穩(wěn)定性都要優(yōu)于酶解法所得大豆多肽。 8、以發(fā)酵法制備的大豆多肽為原料，開發(fā)研制了大豆多肽功能性飲料。其最佳配方是以大豆多肽液(酸溶性多肽含量16mg/mL)為母液；各種添加劑添加量(W/V)分別為β-環(huán)糊精0.4％、檸檬酸0.2％、蔗糖9％、橙汁香精0.4％。最佳滅菌工藝采用微波滅菌法(80℃，10min)。最佳貯藏條件為冷藏(4℃)，在不添加任何穩(wěn)定劑的情況下冷藏可放置2個月。功能性試驗表明，以不同劑量的多肽飲料喂飲小鼠，