衍生自枯草芽孢桿菌MrpF的疏水多肽對蛋白膜錨定的研究.pdf

1、本研究研利用一種枯草芽孢桿菌膜蛋白MrpF作為膜錨定分子，錨定一些親水性蛋白到大腸桿菌細胞膜表面，本研究中選定了一種較為常用，穩(wěn)定且活性易于檢測的親水性蛋白PhoA來錨定。首先利用計算機預(yù)測了MrpF的結(jié)構(gòu)和疏水性。得出MrpF一種三次跨膜的膜蛋白依據(jù)計算機預(yù)測的結(jié)構(gòu)，設(shè)計了PhoA-MrpF融合蛋白。通過基因克隆的方法從大腸桿菌內(nèi)克隆出phoA基因，然后通過基因融合的方法，將phoA基因融合于mrpF基因上游，構(gòu)建出PhoA-MrpF

2、融合蛋白的基因，再導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)其表達。表達結(jié)果顯示融合蛋白表達良好，PhoA顯示出較高的酶活性。且在融合MrpF后，PhoA即被錨定在MrpF上。這一結(jié)果證明MrpF可以將PhoA錨定于細胞膜同時不會明顯影響PhoA的表達和活性。在此基礎(chǔ)上，對MrpF進行截短改造。當MrpF截至一個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域后，PhoA仍能表現(xiàn)出高度的活性，并且錨定于細胞膜。對MrpF進一步截短，研究其能夠?qū)崿F(xiàn)PhoA膜錨定的最短長度。為檢測PhoA錨定于細胞

3、膜的效率，發(fā)展了一些細胞處理和酶活檢測方法。一種是采用溶菌酶直接消化掉細胞壁，EDTA使外膜解體，從而使細胞周質(zhì)的PhoA直接暴露出來，游離的PhoA將被洗脫掉，錨地在膜上的PhoA則依然在細胞上從而被檢測到。另一種方法是滲透壓法(osmotic shock)。這種方法能夠?qū)⒅苜|(zhì)蛋白從周質(zhì)釋放出，但是如果PhoA被錨定在膜上，就不會被釋放。這兩種方法各自獨立，互相映證。在計算機預(yù)測的基礎(chǔ)上，構(gòu)建出了一系列截短的MrpF與堿性磷酸酶的融合

4、蛋白。然后導(dǎo)入大腸桿菌誘導(dǎo)表達。利用上述方法檢測其膜定位效率。研究結(jié)果指出，能實現(xiàn)PhoA膜定位的最短疏水標簽長度為8個氨基酸。
　　 本研究的結(jié)論可以從兩個方面闡述其意義。一是從理論方面，細胞蛋白跨膜轉(zhuǎn)運機制一直是生命科學(xué)研究的一個難題，到目前為止還沒有一個明確的理論解釋蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運，膜蛋白的膜插入等機制，本研究得出了一個最短的膜錨定疏水多肽長度，提示這個長度可能是蛋白轉(zhuǎn)運中被識別的最短的終止轉(zhuǎn)運序列，為這一類研究提供了部分