枯草芽孢桿菌中性蛋白酶nprE的定向進化研究.pdf

1、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(neutralprotease)，是一類被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的酶類，在洗滌劑、制革、絲綢、食品加工等多種行業(yè)上有著廣泛的用途。本課題主要是通過體外定向分子進化技術(shù)，改造nprE基因，從而構(gòu)建能夠高效穩(wěn)定生產(chǎn)中性蛋白酶的枯草芽孢桿菌菌株。主要結(jié)果如下： 1.運用PCR技術(shù)，從枯草芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴增出強啟動子P43序列和nprE全長基因?？寺〉絧MD18-T載體中，鑒定了上述基因。標(biāo)準(zhǔn)株nprE序列與已公布序

2、列完全相同。 2.鑒定了產(chǎn)蛋白酶效率較高的11株分離株，PCR擴增得到其中8株的nprE全長基因。 3.構(gòu)建枯草芽孢桿菌原核表達載體pNP43-nprE，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌168菌株，并在枯草芽孢桿菌中表達，12％SDS。PAGE電泳分析，重組菌可表達分子量分別約為42kDa的蛋白。經(jīng)抗生素壓力選擇后，表達量在OD600為0.8時，酶產(chǎn)量出現(xiàn)最高，粗酶液酶活力達到了出發(fā)菌株的3倍。 3.以nprE全長基因為

3、出發(fā)點，應(yīng)用基因家族改組(FamillyDNAShuffling)技術(shù)，以標(biāo)準(zhǔn)株和野生型菌株的nprE基因作為材料，對其進行突變。在酶產(chǎn)率未提高的情況下，第一輪篩選，突變株酶活力提高了126％，以第一輪篩選的高活力突變株為基礎(chǔ)進行第二輪突變和篩選，酶活力又提高了將近90％，且能夠穩(wěn)定遺傳。分析表明，nprE基因的堿基發(fā)生了改變。這種改變引起了其產(chǎn)物中性蛋白酶分子的氨基酸的改變，從而造成酶活力的改變。 通過比較，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用表達載體在