枯草芽孢桿菌尿酸氧化酶的定向進(jìn)化.pdf

1、尿酸氧化酶是嘌呤代謝路徑中重要的酶，它能夠降解尿酸形成尿囊素，后者在水中的溶解度是前者的十幾倍，能夠大大降低體內(nèi)尿酸的含量。人體中缺乏有活性的尿酸氧化酶，因此體內(nèi)的尿酸水平較高，這在進(jìn)化上是非常具有意義的，然而當(dāng)體內(nèi)尿酸濃度長期處于高水平狀態(tài)時，會引發(fā)包括痛風(fēng)在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。
　　臨床上治療痛風(fēng)主要依靠別嘌呤醇，它通過抑制黃嘌呤氧化酶從而減少體內(nèi)尿酸的生成。然而，別嘌呤醇的使用增加了腎臟的負(fù)擔(dān)并且可能會引起過敏反應(yīng)。尿酸氧化

2、酶作為一種新型的降解尿酸藥物不僅能夠迅速降低血液中尿酸的水平，還能夠降解體內(nèi)沉積的尿酸晶體并且不產(chǎn)生任何副作用。同時尿酸氧化酶還可以用來制作尿酸檢測試劑盒，能夠快速檢測出尿酸的濃度，這在臨床診斷上是非常具有意義的。
　　本研究以枯草芽孢桿菌來源的尿酸氧化酶為出發(fā)點(diǎn)，通過易錯PCR，DNA重組等多種手段構(gòu)建突變庫，最終經(jīng)過多輪的突變和篩選我們獲得了兩個酶活力單位明顯增高的突變體6E9和8E279，這兩個突變體的酶活分別是9.09U/

3、mg和10.44U/mg，均為野生型尿酸氧化酶活力單位的3倍左右。我們?nèi)斯ず铣闪它S曲霉來源的尿酸氧化酶基因，并檢測其酶活力，發(fā)現(xiàn)其酶活與突變體8E279類似。同時我們檢測了突變體和野生型的理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)突變體相比野生型尿酸氧化酶具有更低的最適反應(yīng)溫度和最適pH，更好的熱穩(wěn)定性。我們利用定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建出17個含有單突變體的菌株，通過檢測純酶活力單位大小，我們知道D44V，Q268R和K285Q這三個位點(diǎn)的突變導(dǎo)致酶活力增加的幅度最大。

4、我們進(jìn)一步將這三個突變位點(diǎn)隨機(jī)組合，得到酶活力單位最高的突變體DQ，它的動力學(xué)參數(shù)Km，kcat/Km和酶活力單位分別增加了68％，83％和129％。我們利用同源建模得到枯草芽孢桿菌的模擬結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，所有的突變位點(diǎn)都不在活性位點(diǎn)附近，雖然它們的突變導(dǎo)致了酶活性的改變，但是只從靜態(tài)結(jié)構(gòu)并不能解釋具體的催化機(jī)制;我們同時選擇了一些突變位點(diǎn)進(jìn)行回復(fù)突變，發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)在突變體和野生型中的效應(yīng)明顯不同，這暗示這些突變位點(diǎn)具有非常強(qiáng)的異位顯