枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶的定向進化及其代謝工程應用.pdf

1、枯草芽孢桿菌中，purA基因編碼的腺苷琥珀酸（Adenylosuccinate，sAMP）合成酶催化IMP生成sAMP，是重要的節(jié)點流量控制關鍵酶。然而在已有的文獻報道中，purA基因的失活盡管能夠提高肌苷、鳥苷以及核黃素等的產量，但對菌體的生長都產生了極大影響，不僅造成后續(xù)的基因操作變得困難，同時也延長了發(fā)酵周期。本研究通過前期實驗數據和分子模擬預測結果，尋找purA基因關鍵突變點，構建點飽和突變文庫，進一步以突變株的生長和核黃素產量

2、為考察指標，篩選到sAMP合成酶的最優(yōu)滲漏突變，并研究了該滲漏突變在枯草芽孢桿菌合成肌苷中的代謝工程應用。
　　本研究首先構建了木糖操縱子誘導的comK過表達菌SS2，作為點飽和突變文庫的宿主菌；隨后，構建了含有新霉素抗性基因及purAC725T基因片段的點飽和突變模板質粒pSSN-purA。進一步利用全質粒擴增的方法，構建Pro242或Thr238位點的點飽和突變文庫。根據突變株的生長狀況和核黃素產量得到最優(yōu)突變型P242N。P

3、242N突變型菌株的生長狀態(tài)與野生型幾乎一致，且其酶活較野生型降低了53.6％。說明了P242N突變型的sAMP合成酶的酶活部分降低，能夠在保證菌體正常生長的同時，提高了IMP流向GMP的通量。
　　進一步選擇肌苷作為目的產物，考察P242N突變對嘌呤代謝途徑小分子代謝物產量的影響。首先通過敲除purR、過表達purF解調嘌呤代謝途徑；隨后，敲除肌苷分解途徑基因deoD和pupG，構建了肌苷生產菌株I12；最后，向I12中引入pu