產(chǎn)莽草酸枯草芽孢胞桿菌代謝工程改造及代謝流分析.pdf

1、以莽草酸為原料可以通過化學(xué)合成或微生物合成法生產(chǎn)抗禽流感病毒藥物—GS4104（達(dá)菲）。莽草酸也是生物代謝途徑中重要的中間體，是合成許多生物堿以及芳香氨基酸(L-Phe， L-Trp和L-Tyr)的原料。作為一個商業(yè)產(chǎn)品，莽草酸主要從八角茴香中提取。然而，利用微生物發(fā)酵方法生產(chǎn)莽草酸受到越來越多的關(guān)注。
　　起始于PEP和E4P，莽草酸通過莽草酸途徑的前四步反應(yīng)合成而來。對于微生物生長來說，莽草酸途徑是必須的，目前仍然沒有關(guān)于微生

2、物自然累積莽草酸的報道。目前，利用微生物生產(chǎn)莽草酸的工作主要集中在大腸桿菌，而利用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)莽草酸鮮有報道。關(guān)于高產(chǎn)莽草酸菌株的代謝流工作前人沒有開展。本研究中，我們利用代謝工程的方法對枯草芽孢桿菌進(jìn)行改造并測定了莽草酸高產(chǎn)菌株的代謝流分布。
　　B.subtilis1A474的莽草酸激酶基因(aroI)有一個位點發(fā)生突變，積累1.5 g/L的莽草酸;B.subtilis1A229的EPSP合成酶基因(aroE)有一個位點發(fā)

3、生突變，積累0.6g/L的莽草酸。在B.subtilis1A474中分別單獨過表達(dá)aroA，aroB，aroC或aroD，結(jié)果表明過表達(dá)aroD莽草酸產(chǎn)量增長最多;在B.subtilis1A229中分別單獨過表達(dá)aroA，aroB，aroC，aroD或aroI，結(jié)果表明過表達(dá)aroA莽草酸產(chǎn)量增長最多。在B.subtilis1A47407或B.subtilis1A22911中同時過表達(dá)aroA和aroD，莽草酸產(chǎn)量最高，分別為3.2 g

4、/L或1.5 g/L。B.subtilis BSSA47407被用于下一步研究。蔗糖為其最適碳源;最適蔗糖初始濃度為80 g/L;B.subtilis BSSA47407批式補(bǔ)料發(fā)酵莽草酸產(chǎn)量達(dá)到17.8 g/L，其值為普通搖瓶發(fā)酵莽草酸產(chǎn)量的5.6倍。
　　13C代謝流分析菌株BSSA474a和BSSA47407揭示以下結(jié)果:從葡萄糖到莽草酸途徑的流量由BSSA474a中的4.4％增加到BSSA47407中的6.8％;從葡萄糖到

5、莽草酸的流量由BSSA474a中的1.9％增加到BSSA47407中的4.6％;從葡萄糖到3-脫氫莽草酸的流量由BSSA474a中的2.5％減小到BSSA47407中的2.2％;經(jīng)過TCA循環(huán)的流量減小;而通過磷酸戊糖途徑和糖酵解途徑的流量變化不大?；诖x流量結(jié)果，兩個代謝改造目標(biāo)被提出。實驗結(jié)果表明:敲除pyk加了莽草酸產(chǎn)量，而過表達(dá)tkt并沒有增加莽草酸產(chǎn)量。
　　本研究利用SLIC的方法一次將aroD， aroB，aroA