基于LC-MS的產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌代謝物組的初步研究.pdf

1、本文對(duì)四株不同產(chǎn)核黃素工程菌的胞內(nèi)代謝物進(jìn)行了比較研究。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 首先對(duì)細(xì)胞滅活和胞內(nèi)代謝物的提取方法進(jìn)行了優(yōu)化。確定了快速過濾收集菌體的方法分離獲取細(xì)胞；采用高氯酸提取方法進(jìn)行胞內(nèi)代謝物提取。 其次，本文確定了進(jìn)行胞內(nèi)代謝物檢測(cè)的取樣點(diǎn)。通過對(duì)菌體的生長(zhǎng)狀況的分析分別確定了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的取樣時(shí)間。 在此基礎(chǔ)上，本文采取STD-MS/MS、STD、MS/MS、MS的方法，定性確定了24種胞內(nèi)

2、代謝物，并對(duì)其中11種胞內(nèi)代謝物進(jìn)行了精確定量分析。 通過對(duì)四種不同產(chǎn)核黃素工程菌胞內(nèi)代謝物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：purF基因過量表達(dá)加快了PRPP到PRA的反應(yīng)速率，致使PRPP胞內(nèi)濃度降低。在RH33-purF中，GMP、GDP、以及核黃素的重要前體物GTP的胞內(nèi)濃度也隨著增加，從而提高了目標(biāo)產(chǎn)物核黃素的產(chǎn)量。 在RH44-purF中，同樣的基因修飾并沒有引起GTP濃度的增加，核黃素產(chǎn)量也并沒有得到提高。這可能是由于在RH44

3、-purF中，高濃度的PRPP對(duì)嘌呤操縱子的轉(zhuǎn)錄有很強(qiáng)的促進(jìn)作用，使嘌呤合成途徑不是RH44核黃素合成的限制因素。另外一個(gè)原因可能是由于ADP和GMP對(duì)purF編碼的谷氨酰胺PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶的協(xié)同抑制作用降低了purF基因擴(kuò)增的效果。 較高的胞內(nèi)G6P和PEP濃度可能是造成RH33-purF葡萄糖的消耗速率緩慢的原因。另外還發(fā)現(xiàn)，在RH33系列菌株中，R5P的供給比較充足。因此，強(qiáng)化R5P向PRPP的轉(zhuǎn)化可以繼續(xù)提高其核黃素產(chǎn)量