產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌ribAH基因在ccpA基因位點(diǎn)的表達(dá).pdf

1、重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素的技術(shù)是目前最先進(jìn)的核黃素工業(yè)生產(chǎn)方法。構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的重組菌，關(guān)鍵問題之一是提高核黃素操縱子的表達(dá)水平。增加核黃素操縱子的拷貝數(shù)，并采用強(qiáng)啟動(dòng)子表達(dá)，是解決這一問題的必由之路。而常用技術(shù)手段是利用游離或整合型的表達(dá)質(zhì)粒，在受體菌中表達(dá)核黃素操縱子。本文研究了利用染色體上ccpA基因的表達(dá)元件，表達(dá)核黃素操縱子中ribAH基因，以探討一種提高核黃素操縱子表達(dá)水平的簡(jiǎn)便、多效方法。 首先通過對(duì)ccpA基因

2、表達(dá)元件進(jìn)行序列分析和比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其在多方面都非常符合強(qiáng)啟動(dòng)子的特征；ccpA基因編碼全局調(diào)控蛋白CcpA，對(duì)200多個(gè)基因具有調(diào)控作用，也從另一個(gè)角度證明其表達(dá)元件具有突出的表達(dá)能力。 以產(chǎn)核黃素重組菌B.subtilis 24為出發(fā)菌株，對(duì)其recA基因的缺陷進(jìn)行了恢復(fù)，得到B.subtilis 24 Y1。然后利用lipA::Cm片段和lipA::Cm-recA片段分別轉(zhuǎn)化B.subtilis 24Y1，根據(jù)氯霉素抗性轉(zhuǎn)化子

3、出現(xiàn)頻率，考察了B.subtilis 24Y1的同源重組能力。發(fā)現(xiàn)B.subtilis 24Y1幾乎不能發(fā)生同源重組，而連接recA基因的同源片段重組頻率能夠達(dá)到10-7。 通過重疊PCR擴(kuò)增了一段帶有點(diǎn)突變的ribAH基因，經(jīng)轉(zhuǎn)化B.subtilis 24Y1，通過同源重組在ribAH結(jié)構(gòu)基因中引入了兩個(gè)連續(xù)的終止密碼子，得到ribAH基因缺陷株B.subtilis 24 Y3。其核黃素產(chǎn)量從1.8 g/L降低到0.4g/L，

4、菌落顏色由黃色變?yōu)榘咨?。該ribAH缺陷株作為在ccpA位點(diǎn)表達(dá)ribAH的受體菌，而菌落顏色將成為方便的篩選標(biāo)記。 采用重疊PCR拼接方法，將ccpA基因的啟動(dòng)子片段、ribAH結(jié)構(gòu)基因、ccpA的終止子片段，以及recA基因相連；連接片段轉(zhuǎn)化B.subtilis 24 Y3，通過雙交換重組，得到了ccpA的結(jié)構(gòu)基因被ribAH置換的B.subtilis 24 Y5。同時(shí)，還得到了ccpd的結(jié)構(gòu)基因被ribAH置換，ribAH