α-乙酰乳酸脫羧酶基因在枯草芽孢桿菌中的整合型表達.pdf

1、啤酒中的一種重要風味物質(zhì)是雙乙酰(diacetyl)，它是在啤酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，當它的含量過高時會使啤酒喝起來感覺有餿飯味。因此，除去雙乙酰、降低雙乙酰含量是啤酒成熟的一個重要標志。然而這一過程在自然發(fā)酵過程中通常很緩慢。α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactatedecarboxylase，EC.4.1.1.5．簡稱為ALDC)能加速這一過程，它催化雙乙酰的前體物α-乙酰乳酸(α-acetolactate)脫羧形成乙偶姻(ace

2、toin)，減少雙乙酰的生成，而形成的乙偶姻對啤酒口味沒有太大影響的。因此在啤酒生產(chǎn)過程中加入α-乙酰乳酸脫羧酶是有效減少雙乙酰含量的辦法之一。
　　 到目前為止，作為一種研究得較透切的微生物，大腸桿菌(Escherichiacoli)作為宿主菌成功表達了很多種蛋白質(zhì)，但大腸桿菌表達系統(tǒng)仍然存在一些缺陷，例如含有內(nèi)毒素（脂多糖）、具有致病性、蛋白質(zhì)難于分泌表達、易形成包含體等。枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)分

3、泌表達外源蛋白能力強，是目前原核表達系統(tǒng)中較理想的宿主。近幾年利用枯草芽胞桿菌作為宿主菌成功表達了多種外源基因，例如利用來源于乳酸桿菌、金黃色葡萄球菌等的載體來表達外源基因，這些載體在枯草芽胞桿菌中存在外源基因的克隆表達效率低及分離復制的不穩(wěn)定的現(xiàn)象，故都不是枯草芽胞桿菌的最佳選擇，還有待改進。鑒于此，發(fā)展起來了整合載體。整合載體是將外源目的基因整合到宿主菌染色體上，隨著染色體一同復制遺傳，解決了染色體外復制質(zhì)粒在宿主中遺傳不穩(wěn)定的問題

4、。當然，一套好的表達系統(tǒng)不僅保持分裂的穩(wěn)定性、能遺傳和能分泌表達蛋白質(zhì)，此外還應該有一些高效表達的元件（例如具有強啟動子等）。
　　 本研究以α-乙酰乳酸脫羧酶基因為研究對象，構建了枯草芽孢桿菌穩(wěn)定的表達系統(tǒng)。具體方法是采用PCR技術從枯草芽孢桿菌1A751染色體基因組DNA中擴增出P43啟動子，酶切連接到本實驗室構建的攜帶有α-乙酰乳酸脫羧酶基因的質(zhì)粒pUC19-ALDC上，得到重組質(zhì)粒pUC19-P43-ALDC。酶切質(zhì)粒p

5、UC19-P43-ALDC，將含P43-ALDC基因片段與線性化質(zhì)粒pMLK83-BN轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α，根據(jù)同源重組得到重組質(zhì)粒pMLK83-ALDC，重組質(zhì)粒pMLK83-ALDC再轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌1A751，通過新霉素抗性和淀粉酶失活篩選出重組枯草芽孢桿菌1A751[ALDC]。
　　 實驗結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌1A751[ALDC]表達產(chǎn)物能有效分泌到胞外且具有正常的生物學活性。過夜搖瓶培養(yǎng)，上清ALDC酶活達到15