枯草芽孢桿菌lipA基因表達元件的修飾.pdf

1、在微生物的基因工程育種中，使用強啟動子和穩(wěn)定子表達目的基因，可以獲得高水平的表達效果。本文選擇噬菌體Φ29的A1啟動子和枯草芽孢桿菌aprE基因的穩(wěn)定子，構成一個新的表達盒，用于在枯草芽孢桿菌DB104染色體上替換lipA基因原有的表達元件。本文主要對lipA基因表達元件原位修飾的基因操作方法進行了研究。
　　 采用重疊PCR方法，將兩個lipA基因同源片段和紅霉素抗性基因片段拼接，得到重組片段LE：LE與質(zhì)粒pEASY-T1載

2、體連接，在大腸桿菌中構建了重組質(zhì)粒pT1-LE；轉化枯草芽孢桿菌DB104，篩選得到了具有紅霉素抗性的lipA基因缺陷菌株DB104E。構建了帶有野生型lipA基因片段的重組質(zhì)粒pT1-LA，用于轉化DB104E，可以恢復lipA基因的缺陷；并發(fā)現(xiàn)lipA+菌株可以在橄欖油基本培養(yǎng)基上生長，而lipA-菌株則不能生長，橄欖油基本培養(yǎng)基能夠用于篩選lipA+的轉化子。通過重疊PCR方法，將A1啟動子序列、aprE穩(wěn)定子序列和上下游lipA

3、基因同源序列拼接，得到了重組片段LPAS，與質(zhì)粒pEASY-T1 Simple連接，在大腸桿菌中構建了重組質(zhì)粒pT1-PAs；通過對質(zhì)粒pT1-PAs的測序，證明A1啟動子序列和aprE穩(wěn)定子序列按照預定設計拼接成一個表達盒；但質(zhì)粒pT1-PAs轉化DB104E，在橄欖油基本培養(yǎng)基上不能篩選出轉化子，推測因為可能是表達盒沒有功能，或者轉化方法存在問題。為了證明在pT1-PAs轉化過程中基因重組確實發(fā)生，采用酶切連接的方法，將氯霉素抗性基