枯草芽孢桿菌rocG基因插入失活突變株的構(gòu)建.pdf

1、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是革蘭氏陽(yáng)性產(chǎn)孢菌的模式菌株,納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種,其發(fā)酵生產(chǎn)的納豆是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的食品,但由于Bacillus natto代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的氨,嚴(yán)重影響了其風(fēng)味,因此,研究枯草芽孢桿菌的產(chǎn)氨代謝途徑具有非常重要的實(shí)際意義。
　　在枯草芽孢桿菌的產(chǎn)氨代謝中,谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogena

2、ses,GDH)是連接碳代謝和氮代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶?？莶菅挎邨U菌中編碼GDH的基因有兩個(gè):rocG基因和gudB基因。其中B. subtilis168菌株的rocG基因編碼有活性的GDH,而gudB基因編碼沒有活性的GDH。敲除B. subtilis168菌株的rocG基因后,gudB基因會(huì)自發(fā)突變?yōu)間udB1基因,編碼有活性的GDH(gudB1-GDH)。枯草芽孢桿菌GDH在代謝中的作用及調(diào)控機(jī)制已經(jīng)取得了一些研究進(jìn)展,但僅局限于roc

3、G-GDH的分析,而缺乏對(duì)gudB1-GDH的研究。
　　為了研究gudB1-GDH在代謝中的作用及調(diào)控機(jī)制,以B. subtilis168 DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增了829 bp的rocG同源重組序列,并引入了Hind III和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)。通過酶切酶連,將測(cè)序正確的rocG同源重組序列連至pMUTin4的Hind III和BamH I酶切位點(diǎn)間,成功構(gòu)建了pMUTin4-rocG插入突變重組質(zhì)粒,然后將其轉(zhuǎn)化至B

4、. subtilis168,通過PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證后,成功獲得了一株rocG失活突變株BS-△rocG,并對(duì)突變株和野生株的生長(zhǎng)情況及GDH酶活做了初步比較,發(fā)現(xiàn)突變株生長(zhǎng)情況和野生株相當(dāng),但突變株GDH酶活為4.641 U/mg蛋白,高于野生株的3.042 U/mg蛋白。因此得到的BS-△rocG中,gudB可能自發(fā)突變?yōu)?gudB1,從而能夠編碼有活性的GDH,為研究枯草芽孢桿菌gudB1-GDH在代謝中的作用及調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)

5、。
　　同時(shí),為了改善納豆風(fēng)味,將B. subtilis168 rocG插入失活突變株構(gòu)建的方法運(yùn)用到本課題組從商品納豆中分離得到的Bacillus natto(CGMCC No.2801)中,以Bacillus natto的DNA為模板,同樣擴(kuò)增了829 bp的rocG同源重組序列,將其連至pMUTin4上,成功構(gòu)建了Bacillus natto rocG插入失活載體pMUTin4-rocG1。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法,將pMUTin