產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌中心碳代謝的代謝工程.pdf

1、本文以代謝工程的理論為指導(dǎo)，圍繞產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的中心碳代謝進(jìn)行遺傳改造，以減少酸性副產(chǎn)物乙酸的生成，提高碳的轉(zhuǎn)化率，并構(gòu)建了一系列的產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的基因工程菌，比較系統(tǒng)地研究中心碳代謝的的遺傳改造對(duì)枯草芽孢桿菌的核黃素生物合成的影響，得到的主要結(jié)果如下： 1.建立產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，進(jìn)行了通量平衡分析和代謝通量分析的對(duì)比。發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌的核黃素得率最大時(shí)，不產(chǎn)生酸性代謝物乙酸、乳酸和丙酮酸等，并預(yù)

2、測進(jìn)一步遺傳改造的靶點(diǎn)。 2.構(gòu)建了pta基因缺失的產(chǎn)核黃素工程菌，pta基因缺失工程菌與其親株相比，pta基因缺失使得菌體生長緩慢。代謝分析表明，pta基因缺失減少乙酸的生物合成，伴隨著丙酮酸積累。隨后在pta基因缺失工程菌中擴(kuò)增alsS基因，發(fā)現(xiàn)alsS基因擴(kuò)增使得枯草芽孢桿菌有能力將丙酮酸導(dǎo)向3-羥基丁酮生物合成途徑，降低丙酮酸的積累，同時(shí)改善了菌體的生長，可在0.5％葡萄糖基本培養(yǎng)基積累核黃素54.4 mg/L，比出發(fā)

3、菌株RH33::[pRB63]n提高了85.7％。遺傳改造后代謝通量分析表明，中心碳代謝的遺傳擾動(dòng)對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的通量分配影響很小，但這些微小變化促進(jìn)核黃素生物合成途徑通量的改善。 3.研究了gdh基因的擴(kuò)增對(duì)枯草芽孢桿菌核黃素生物合成能力的影響。結(jié)果表明：擴(kuò)增gdh基因使得菌株在0.5％葡萄糖基本培養(yǎng)基積累核黃素37.2 mg/L，比出發(fā)菌株RH33::[pRB63]n提高了29.7％，同時(shí)降低酸性副產(chǎn)物生成速率，這表明

4、提高葡萄糖酸支路的通量有利于核黃素的積累。 4.對(duì)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶靶點(diǎn)進(jìn)行遺傳改造，構(gòu)建pgi基因缺失工程菌。通過對(duì)其發(fā)酵和生長的研究得出結(jié)論：pgi基因缺失使菌體生長緩慢，利用葡萄糖的能力降低，但當(dāng)培養(yǎng)基中添加適量酵母抽提物時(shí)，可以改善菌體生長和糖的利用，可在0.5％葡萄糖基本培養(yǎng)基積累核黃素35.9 mg/L，比出發(fā)菌株提高了25.1％。 5.6-磷酸葡萄糖節(jié)點(diǎn)的代謝控制分析表明，降低糖酵解的通量能有效地提高磷酸