產(chǎn)核黃素Bacillus subtilis中心代謝途徑代謝工程和比較基因組學.pdf

1、本文首先以調(diào)控中心代謝途徑通量為代謝工程策略，研究了戊糖磷酸途徑和糖異生途徑中關鍵酶基因擾動對枯草芽孢桿菌核黃素合成的影響；其次，利用454 GS FLX高通量測序系統(tǒng)測定了核黃素生產(chǎn)菌B.subtilis24和B.subtilisRH33的基因組，實現(xiàn)了基于全基因組的突變分析和分類，并構建了用于突變分析和菌株重構的技術平臺。
　　 利用定點突變技術改造C.glutaminum的zwf和gnd基因，得到解除變構抑制作用的編碼酶基

2、因zwf243和gnd361。分別表達zwf243和gnd361時能夠顯著提高 B.subtilis RH133核黃素的合成，核黃素搖瓶產(chǎn)量分別達到4.66g/L和4.82g/L，提高了18.0％和22.0％。兩突變基因同時表達時，核黃素搖瓶產(chǎn)量為5.17g/L，葡萄糖限制補料培養(yǎng)核黃素產(chǎn)量為15.7g/L，分別提高了30.9％和39％?；?LC-MS的胞內(nèi)代謝物譜分析表明，工程菌胞內(nèi)戊糖磷酸途徑代謝物如核黃素及其前體物 AIR、DR

3、L和 Ru5P濃度均比宿主菌顯著增加，提高了15％-46％；相反，三羧酸循環(huán)和糖酵解途徑中的代謝物濃度比工程菌降低。
　　 構建了糖異生途徑關鍵酶基因pckA、gapB和fbp整合型表達載體pUC18-TPA，pUC18-NPB，pUC18-SPF以及fbp與gapB共表達載體pUC18-PFB和 fbp，gapB與pckA共表達載體pUC18-PFBA。以葡萄糖為碳源的搖瓶發(fā)酵結果表明，fbp基因的過表達對核黃素的合成影響最大

4、，核黃素產(chǎn)量達到4.73g/L，提高18％左右；關鍵酶基因共表達核黃素發(fā)酵結果表明，fbp和gapB基因共表達對核黃素的合成影響最大，產(chǎn)量提高22％左右，達到4.89g/L。
　　 利用Roche454 GS FLX系統(tǒng)測定了核黃素生產(chǎn)菌B.subtilis24和B.subtilisRH33基因組，平均讀長分別為388bp和394bp，覆蓋率高達48倍和46倍；結合Sanger法測序補齊缺口，組裝全基因組，B.subtilis2

5、4和B.subtilis RH33的全基因組的大小分別為4194978bp和4195221bp，G+C含量均為43.55％。
　　 全基因組的突變分析表明，B.subtilis24中含有突變512個，其中插入突變29個，缺失突變20個，替代突變463個：B.subtilis RH33中含有突變549個，其中插入突變31個，缺失突變24個，替代突變494個；兩基因組的比對分析結果表明，B.subtilis24和 B.subtili