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文檔簡介
1、盡管乳酸菌的分類是基于它們厭氧或者微好氧條件下代謝葡萄糖產(chǎn)生乳酸的能力,許多乳酸菌都可以在有氧條件下生長代謝并利用乳酸。乳酸桿菌(Lactobacillus)屬于典型的乳酸菌,由于其風(fēng)味特性、益生特性、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力及發(fā)酵過程中的易用性,常被用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的生產(chǎn)中。乳酸桿菌在有氧條件下的生理代謝各不相同,如何充分利用有氧生長獲取高密度的菌體細(xì)胞并通過降低氧脅迫保持較高的細(xì)胞活性,對于其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要的
2、意義。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),在動物日糧中添加B.subtilis可以明顯增加胃腸道和糞便中乳桿菌的數(shù)量,但其機(jī)理還沒有得到充分解釋。
因此,本文以植物乳桿菌(Lb.plantarum)、短小乳桿菌(Lb.brevis)為對象,對其有氧代謝進(jìn)行了研究,同時(shí)以B.subtilis168為對象,基于乳桿菌的有氧代謝對其益生作用機(jī)制進(jìn)行探討,另外
3、還對乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑的工藝創(chuàng)新進(jìn)行了初步探索,具體結(jié)果如下:
1.Lb.plantarum的發(fā)酵、有氧代謝與氧脅迫
Lb.plantarum是一種廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品、青貯飼料和益生菌制劑的菌株。本文研究了Lb.plantarum LA1在MRS(0.5%葡萄糖)培養(yǎng)基中、以下四種條件下:
①厭氧條件(靜止培養(yǎng));
②有氧條件(搖動培養(yǎng));
4、③有氧呼吸條件(搖動培養(yǎng)+外源血紅素和維生素K2,即將其電子傳遞鏈補(bǔ)充完整);
④過氧化氫酶保護(hù)條件(搖動培養(yǎng)+外源血紅素,即激活其自身過氧化氫酶)下的代謝特性,包括:
①生物量(OD600);
②細(xì)胞活力(CFU/mL);
③葡萄糖代謝產(chǎn)物(乳酸、乙酸、乙醇);
④氧脅迫(培養(yǎng)基中H2O2含量)。
氧氣參與Lb.plantarum LA1的代謝時(shí)對其具
5、有明顯的兩面性。有氧代謝可使其最高菌體密度從3.5提高至5.0左右,但同時(shí)會產(chǎn)生高達(dá)3-4 mM的H2O2,因此達(dá)到生長峰值后細(xì)胞因嚴(yán)重的氧脅迫迅速開始死亡,24小時(shí)以后幾乎不能檢測到活菌。Lb.plantarum發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸,而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔铮⑶以谔砑友t素激活其自身過氧化氫酶后,高活力細(xì)胞可將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸,同時(shí)產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。目前關(guān)于Lb.plantarum有氧呼吸的
6、研究并不充分,本文的結(jié)果說明,有氧呼吸可以進(jìn)一步促進(jìn)Lb.plantarum的有氧代謝,但對生物量的提高作用并不明顯,與其它有氧條件并無顯著差異。
2.Lb.brevis的發(fā)酵與有氧代謝研究
Lb.brevis作為一種重要的發(fā)酵劑,常用于切達(dá)干酪的生產(chǎn),在干酪的成熟中起著重要作用。本文研究了Lb.brevis ATCC367在上述四種條件下的代謝特性。氧氣參與Lb.brevis的代謝時(shí)對其具有顯著的益處,既使
7、其生物量從1.5提高至4.1(搖動條件)甚至5.5(有氧呼吸),又檢測不到H2O2的積累,因此可保持較高的細(xì)胞活力。Lb.brevis發(fā)酵葡萄糖的終產(chǎn)物主要是乳酸,同時(shí)伴有CO2和少量乙醇的生成,而在有氧條件下轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗岷痛罅恳宜岬幕旌衔?,并最終將乳酸完全轉(zhuǎn)化為乙酸,同時(shí)產(chǎn)生額外ATP而獲得更高生物量。Lb.brevis的有氧呼吸未見報(bào)道,本文的結(jié)果說明,有氧呼吸可以顯著促進(jìn)Lb.brevis的有氧代謝,使其比其他三種條件下具有更迅速的
8、代謝轉(zhuǎn)化和更高的生物量。
3.Lb.brevis有氧代謝時(shí)乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化途徑
在Lb.plantarum和Lb.brevis的有氧代謝中均存在乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。目前對Lb.plantarum的這一轉(zhuǎn)化途徑研究比較清楚,即乳酸氧化酶、丙酮酸氧化酶和乙酸激酶途徑,并由丙酮酸氧化酶產(chǎn)生對細(xì)胞有毒性的H2O2。但Lb.brevis在乙酸生成中并無H2O2積累,其具體途徑未見報(bào)道。本研究通過單交換法構(gòu)建了Lb.bre
9、vis ATCC367的丙酮酸脫氫酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pdh和丙酮酸氧化酶缺陷株Lb.brevis ATCC367-pox,其發(fā)酵代謝與野生型并無明顯差異。但是在有氧代謝時(shí),丙酮酸脫氫酶缺陷株的生物量較野生型出現(xiàn)大幅下降,終產(chǎn)物中乳酸增加、乙酸減少,且無乳酸向乙酸的轉(zhuǎn)化。丙酮酸氧化酶缺陷株的有氧代謝與野生型無異。由此證明了丙酮酸脫氫酶在Lb.brevis有氧代謝中的主導(dǎo)作用。另外,real time RT-PCR
10、顯示,在搖動條件下尤其是葡萄糖耗盡時(shí)丙酮酸脫氫酶基因pdh和丙酮酸氧化酶基因pox的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào),證明了氧氣對二者的正調(diào)控和葡萄糖對二者的負(fù)調(diào)控作用。由此,本文闡明了Lb.brevis在有氧代謝時(shí)伴隨額外ATP產(chǎn)生的乳酸乙酸轉(zhuǎn)化途徑,從而為其高密度發(fā)酵和抗氧脅迫提供了理論依據(jù)。
4.B.subtilis協(xié)助乳桿菌對抗氧脅迫
B.subtilis作為一種益生菌廣泛應(yīng)用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè),傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其通過“
11、生物奪氧”機(jī)制為腸道中另一種益生菌——乳酸桿菌創(chuàng)造有利環(huán)境而促進(jìn)其生長。但是腸道中動態(tài)變化的氧氣水平不可避免會地影響乳桿菌的代謝,且一些乳桿菌可在利用氧氣獲得更高生物量的同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的H2O2。本文檢測了B.subtilis在人工腸液中的自裂解現(xiàn)象,并通過HPLC檢測驗(yàn)證了其裂解液中含有血紅素。將B.subtilis168與Lb.plantarum LA1進(jìn)行體外搖動混合培養(yǎng)2天后,Lb.plantarum的細(xì)胞存活力較單獨(dú)通氧培養(yǎng)
12、提高了109倍;或?qū).subtilis的裂解液添加到培養(yǎng)基中,Lb.plantarum自身過氧化氫酶被激活,可維持較高細(xì)胞存活力、較高DNA完整度,且培養(yǎng)物中無H2O2積累。因此,乳桿菌可得益于B.subtilis活菌產(chǎn)生的過氧化氫酶和裂解后產(chǎn)生的血紅素,從而對抗氧脅迫。本研究對B.subtilis現(xiàn)有的益生作用機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步補(bǔ)充。
5.乳桿菌與B.subtilis混合型微生態(tài)制劑工藝創(chuàng)新初探
液態(tài)混合型
13、微生態(tài)制劑的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是將乳桿菌和B.subtilis分別培養(yǎng)后再混合。一些乳桿菌在通氧培養(yǎng)條件下可獲得更高的生物量,但同時(shí)會因遭受氧脅迫(如H2O2)而降低細(xì)胞存活力;B.subtilis是一種好氧菌,對抗氧脅迫的機(jī)制較為完善,它可產(chǎn)生乳桿菌不具有的血紅素和過氧化氫酶。因此二者的混合培養(yǎng)具有許多優(yōu)勢。為在終培養(yǎng)物中達(dá)到高菌體蛋白、高乳桿菌活菌數(shù)和高芽孢數(shù),本文通過對接種狀態(tài)、接種量和接種比例進(jìn)行優(yōu)化,確定了在MRS(0.5%葡萄糖)
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